JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

MicroRNA מבוסס נוזלי ביופסיה: החוויה של miRNA פלזמה החתימה מסווג (MSC) לסינון סרטן ריאות

Published: October 26, 2017
doi:
10.3791/56326
, , , , , , , ,
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט אימצה את BioMILD הקרנת ניסיון לביצוע המבדק המסווג במחזור של החתימה microRNA לגילוי מוקדם של סרטן ריאות.

Abstract

הפיתוח של בדיקה פולשנית, כגון ביופסיה נוזלי, על גילוי מוקדם של סרטן ריאות בשלב פרה חיוני לשפר את התוצאה של המחלה הקטלנית. Rna (miRNAs) הם רקמה ספציפיים, קטן, ללא קידוד RNAs ויסות גנים, אשר עשוי לשמש כשליחים חוץ-תאי של אותות ביולוגיים נגזר מן הצלב-השיחה בין הגידול שלה microenvironment שמסביב. הם יכולים ובכך מייצגים מועמדים אידיאליים לגילוי מוקדם של סרטן ריאות. בעבודה זאת, מוצע זרימת עבודה מתודולוגי לשם אימות פוטנציאליים של מבחן miRNA מחזורי באמצעות כרטיסי microfluidic תוצרת אישית ו- PCR כמותי בזמן אמת בדגימות הפלסמה של מתנדבים נרשם סרטן ריאות הקרנת המשפט. בנוסף, מאז שחרורו של miRNAs הקשורות המוליזה וסוגיות טכני כללי יותר עשוי להשפיע על הניתוח, השלבים בקרת איכות כלול את נהלי מוצגים גם הן. הפרוטוקול הוא לשחזור ונותן תוצאות כמותיות אמינות; עם זאת, בעת שימוש בסדרות גדולות קליני, מראש אנליטית ותכונות אנליטית צריך בזהירות להעריכו.

Introduction

סרטן הריאות הוא ביותר מאובחנים כלל סרטן ברחבי העולם, והיוו כ- 25% של סרטן כל האבחנות1. למרות צמצום קבועה בשיעור התמותה סרטן ריאות במהלך העשורים האחרונים 2, בעיקר בשל השימוש בטבק מופחתת, סרטן ריאות עדיין הגורם המוביל של מקרי המוות מסרטן בקרב גברים ונשים כאחד. ב-2017, הוא ניבא לחשבון עבור 25% ו-20% ממקרי סרטן הכולל בארצות הברית ובאירופה, בהתאמה1,2.

מאז הסימפטומים אינם מתרחשים בדרך כלל במחלה מוקדמת, הרוב המכריע של סרטן הריאות מאובחנים בשלבים מאחרים. זה מוביל לו אפשרות מוגבלת התערבות טיפולית, המסכן יעילותם של טיפולים3. לכן, מאמצים מדעיים רבים מכוונים זיהוי מבחן יעילה לגילוי מוקדם של סרטן ריאות.

מגוון רחב של הקרנת ניסויים מראה כי החזה רדיוגרפיה אין ערך בהקרנת סרטן ריאות, ואילו במינון נמוך שחושב טומוגרפיה (LDCT) הוא כלי טוב יותר בהשוואה רדיוגרפיה לגילוי סרטן ריאות בשלב מוקדם4. יתר על כן, זה הוכח thatscreening עם השימוש LDCT מופחת התמותה בסרטן הריאות עד 20% בקרב מעשנים כבדים בהווה ובעבר5. נתונים אלו תומכים בשימוש של הקרנת סרטן ריאות בקרב אוכלוסיה בסיכון גבוה כפי שהוגדרו בהנחיות על ידי אגודות מקצועיות מספר4,6.

ראוי לציין, בין הדאגות העיקריות על ההקרנה LDCT, יש שיעור גבוה של תוצאות חיוביות שגויות ואבחון יתר. כי ולכן, הקהילה המדעית מחפשת אסטרטגיה להתגבר על בעיות אלה להגביר את ייחודה של הבדיקה הקרנה LDCT. הפיתוח של סמנים ביולוגיים משלימה לא פולשנית עשוי להיות שימושי כאן נכון להיום, יש רשימה מקיפה של סמנים ביולוגיים המועמד תחת חקירה, כגון miRNAs, ללא תא ה-DNA, ג’ין מתילציה, חלבונים קטנים ואחרים7.

מבוסס על דם סמנים ביולוגיים, כולל התגובה החיסונית סמנים ביולוגיים ופיזור miRNAs, הם אלו מתקדמים יותר אימות שלב8. התגובה החיסונית סמנים ביולוגיים מבוססת על הידע שיש תגובות מערכת החיסון כנגד שני תאיים ועל פני שטח גידול אנטיגנים נבנים חולי סרטן ריאות9. למשל, יעל להר. et al. להעריך את התפקיד של C4d, מוצר השפלה של מסלול המשלים הקלאסית, אבחון, הפרוגנוזה של סרטן ריאות10. אחרת, נסיוב זמינים מסחרית עצמיים לבחון בחינת שבע אנטיגנים סרטניים הקשורים לאמת בחולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא, הראה 36% של רגישות ו 91% ירידה לפרטים11. התגובה החיסונית סמנים ביולוגיים מעניינים, אך נדרשים מחקרים אימות נוסף עבור יישום קליני פוטנציאליים.

miRNAs הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs עם מנגנון ההכפלה, משמעות תפקודית גדולה על כל הממלכות מהחי והצומח. תפקיד miRNAs היא להסדיר תרגום חלבונים: הם מדחיקים את הביטוי של קבוצה גדולה של היעד גנים12. זה תועד טוב כי הביטוי ‘שינויים ofmiRNAs לתרום בפתוגנזה של סרטן אנושי ביותר12,13,14. בנוסף, גידול וגם תאי סטרומה לשחרר miRNAs, התייצב על ידי ההתאגדות שלהם לתוך שלפוחיות זעירות או באמצעות ההתאגדות RNA מחייב חלבונים, נוזלי גוף כמו פלזמה, סרום15,16, שתן17 , רוק18. במחזור miRNAs עשוי לשקף ולכן התגובה המארח ו אינטראקציה דינאמית בין הגידול שלה microenvironment19. יחדיו תצפיות אלה הפכו miRNAs במחזור מחלקה המבטיחים של סמנים ביולוגיים איתור של סרטן אנושי.

במחזור miRNAs ניתן להבחין באמצעות שיטות שונות: microarray פלטפורמות20, כמותיים הפוך שעתוק PCR (RT-qPCR)21, והדור הבא רצף (הגדרות)14,22. מחקרים על פרופיל ביטוי שונים בהתבסס על הטכנולוגיות הנ”ל פותחו בשנים האחרונות. Microarray היא טכנולוגיה תפוקה גבוהה, חקרתי עד אלפי miRNAs ב assay בודד אחד. עם זאת, יש טווח דינמי נמוכה וספציפיות לעומת RT-qPCR או הגדרות. בנוסף, microarray היא שיטה שאינם כמותיים, ולכן נדרש נוסף ניסיוני אימות. על פי רצף יכול לאפשר זיהוי miRNAs לא ידוע ומתאימים במיוחד בשלב הגילוי. מצד שני, שיטות המיתרים הם עדיין יקרים ומצריכות ציוד מיוחד, מומחה bioinformaticians, ובכך יגביל את השימוש בהם קוהורטות גדולות אימות, הגדרות קליניים23. כרגע, RT-qPCR היא פלטפורמה המאומצת ביותר במחזור miRNA הזיהוי אבחון/קליני בהקשר24. יש טכנולוגיות RT-qPCR שונות זמינים עבור ניתוח miRNAs, אך RT גזע לופ ואחריו TaqMan PCR היא הנפוצה ביותר25. טכניקה זו הוא מאוד רגיש ומדויק (אפליה נוקלאוטיד יחיד) ויש לו טווח דינמי גבוה; עם זאת, זה מאפשר זיהוי ידוע miRNAs בלבד.

בקרת האיכות microRNA מחקר (מחקר miRQC) על ידי Mestdagh et al. נחקרו בהרחבה את המאפיינים של מספר פלטפורמות זמינים מסחרית miRNAs פרופיל המבוסס על שלוש טכנולוגיות כנ ל26. על ידי ניתוח miRNAs 196 ב רקמות ואת הדוגמאות סרום, הביצועים של פלטפורמות שונות הוערכה במונחים של הפארמצבטית, רגישות, דיוק, ירידה לפרטים, קונקורדנציה של ביטוי דיפרנציאלי. התוצאות הראו כי פלטפורמות בהתבסס על הגדרות microarray טכנולוגיות היה גבוה יותר הפארמצבטית, ירידה לפרטים, אבל פלטפורמות RT-qPCR היו מדויקות יותר, רגיש, היה שיעור גילוי גבוה יותר, במיוחד עבור ה-RNA דגימות קלט נמוכה, כגון גוף נוזלים. לפיכך RT-qPCR כנראה השיטה המתאימה ביותר עבור יישום אפשריות בהאבחון הקליני שגרתית.

בשנת 2011 Sozzi. ואח ניתח את הפרופיל miRNA של דגימות פלסמה שנאסף מתנדבים נרשם הראשון LDCT screeningtrial (INT-IEO ניסיון)27 וחתימות miRNA ארבע הולחן על ידי יחסי הגומלין בין 24 במחזור miRNAs . נוצרו. חתימות אלו היו מסוגלים להפלות אנשים ללא המחלה מחולים עם כל או קטלני סרטן ריאות-הזמן או עד 2 השנים לפני גילוי המחלה LDCT28. עיתון נוסף, באותה קבוצה תיאר לראשונה זמן המסווג חתימה miRNA (MSC), מתקבל על ידי שילוב של החתימות ארבעה miRNA על מנת stratify חולים בשלוש רמות של סיכון: גבוהה, ביניים, נמוך. השירות שלה קליניים אומתה בערכת רטרוספקטיבית גדולה יותר מ-1,000 אנשים שהשתתפו בניסוי ההקרנה מתון, מחקר אקראי השוואה בין זרועות LDCT שנתי או עם זרוע התבוננות29. אכן, השילוב של MSC ו LDCT מופחת הקצב חיובי-false LDCT על ידי כ 5 פעמים, היו שלוש קבוצות הסיכון MSCהקשורים ההישרדות.

בהמשך, בשנת 2013-“דל’אנג’לו IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” (מילאנו, זה) פוטנציאליים הקרנה משפט (BioMILD) יישום LDCT עם פלזמה מבוסס מבחן MSC הושק. מתנדבים שהשתתפו בניסוי BioMILD עוברים גמילה LDCT ודם זה מעובדת באופן מיידי כדי להפריד בין פלזמה עבור miRNA פרופילים באמצעות כרטיסי microfluidic תוצרת מותאם אישית. השילוב של תוצאות LDCT, MSC מגדיר הספציפית הקרנת אלגוריתם24.

בשנת העבודה הנוכחית, פרוטוקול מתודולוגי כולו נעשה שימוש במשפט BioMILD מתואר, החל איסוף דגימת דם, פלסמה בידוד, RNA החילוץ, ועשה 24 miRNAs ביטוי פרופיל משתמש מותאמים אישית RT-qPCR microfluidic קלפים. נתון גבוה העקביות והעבודה הפארמצבטית, הליכים אלה יכול לשמש גם לפיתוח של ביופסיות נוזלי מבוססי miRNA מחלות אחרות.

Protocol

הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המחקר של המוסד שלנו. 1. איסוף הדגימה פלזמה מדגם לאסוף 10 מ”ל של דם מלא האגירה צינורות עם EDTA 2 K מצופים ספריי וחנות בטמפרטורת החדר. הערה: כדי למזער את המוליזה, הפרד פלזמה בתוך שעתיים. אל תאחסן את הדם בטמפרטורה נמוכה (כלומר, 4 ° C) כדי למנוע הלם תרמי תא פירוק להוביל שחרור לא ספציפי miRNA. בתוך 1 h, להפריד את הפלזמה על ידי צעד ראשון צנטריפוגה ב 1,258 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להעביר פלזמה supernatant לתוך צינור 15 מ”ל, הימנעות קשר עם הטבעת לימפוציטית. צנטריפוגה הפלזמה בפעם השנייה ב 1,258 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות Aliquot 1 מ ל פלסמה לתוך cryovials 1.5 mL, הימנעות איסוף השבר פלסמה בבסיס של הצינור. לאחסן את כל aliquots ב − 80 ° C, מלבד אחד עבור הערכת התמס. הניתוח מולקולריים צריכה להתבצע בתוך חמישה שבועות. 2. הערכה של המוליזה על ידי מדידה Spectrophotometric מיד לאחר השלב ההפרדה פלזמה, cuvette עבור ספקטרופוטומטר, ודא 1:10 דילול של המדגם פלזמה ב- PBS X 1 (למשל, µL 100 של פלסמה ב µL 900 1 X PBS) ולערבב homogenize את זה הערה: המדגם פלזמה צריך לא להיות קפוא לפני המדידות spectrophotometric, כמו ההקפאה-הפשרתו של המדגם (ובמיוחד בדגימות lipemic), יכול להוות flocculates להפריע הניתוח spectrophotometric. לקרוא את ספיגת-375 nm, 414 nm, 541 ננומטר, 576 ננומטר ספקטרופוטומטרים UV-Vis, באמצעות תיקון בסיסית התיישב ב 750 ננומטר אורך הנתיב של 10 מ מ. לבצע מדידה ריק באמצעות 1 מ”ל של PBS 1 x. לחשב את היחס בין ספיגת-414 nm ו 375 ננומטר; אם גבוה יותר 1.4, שקול את הדגימה hemolyzed וחזור הנסיגה דם (QC1 טבלה 1). 3. החילוץ-RNA הכולל פלזמה µL להכין פתרון 1-Thioglycerol/המגון (OMG) עם 20 של 1-Thioglycerol לכל מיליליטר המגון פתרון. מאז 1-Thioglycerol הוא צמיגה, בזהירות פיפטה למדידה מדויקת. . תירגע הפתרון OMG על קרח או ב- 2-10 ° C לפני להשתמש בו. הערה: הפתרון עובד יציב ב 2-10 מעלות צלזיוס במשך חודש. להשעות את DNase lyophilized אני על-ידי הוספת µL 275 של נוקלאז ללא מים לתוך הבקבוקון ומערבבים בעדינות (לא מערבולת לעשות). ככלי חזותי, להוסיף 5 µL של כחול לצבוע את DNase משוקם, לוותר על הפתרון לתוך aliquots לשימוש יחיד ללא נוקלאז צינורות. לאחסן DNase משוקם אני ב-30 מעלות צלזיוס ל-10 מעלות צלזיוס החל מ- 200 µL של פלסמה, להוסיף 200 µL של הפתרון OMG צוננת. מערבולת 15-30 s כדי להבטיח המגון מלאה. אם קצף מתרחשת, תן את הדגימה להתפשר על קרח µL להוסיף 200 של פירוק מאגר, 25 µL של Proteinase K מדגם הומוגני, מערבולת 20 ס Incubate הדגימות למשך 15 דקות thermomixer טרופה-37 מעלות צלזיוס. לטעון מחסנית עבור כל דגימה על המגש הסיפון של המכשיר ולמקם את plugger לתנוחה הנכונה. להעביר את lysate אל המיקום המתאים במחסנית כלי. 5 להוסיף µL של DNase אני לפתרון לתנוחה הנכונה במחסנית. 60 להוסיף µL של מים נטולי נוקלאז לבסיס של כל שפופרת • תנאי. בחר " הרובאים “. miRNA רקמות " שיטת ולהתחיל הטיהור אוטומטיים הפעל. ניתן לאחסן את הדגימות RNA סה כ − 80 מעלות צלזיוס. 4. RT מבוסס-Taq להיכנס לבריכה Taq RT תחל עם miRNAs עניין כדי להמיר את הרנ א cDNA עם Taq MicroRNA הפוך שעתוק הקיט. µL להכין 12 של RT תערובת התגובה על קרח בצינור microcentrifuge 1.5 mL בהתאם להנחיות קיט, באמצעות 6 µL של הבריכה מותאמת אישית של פריימר RT Taq. 3 להוסיף µL של סה כ RNA עבור אמצעי אחסון הסופי של 15 µL, דגירה בקרח במשך 5 דק. לטעון התגובה RT-תרמו-הצנטרפוגה מוגדר כדלקמן: 16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, והחזק ב-4 מעלות צלזיוס הערה: cDNA יכולה להיות חנות ב-15 ל-20 ° C למשך לפחות שבוע. 5. קדם הגברה µL 2.5 מיקס של כל מוצר RT עם 12.5 µL 2 x מיקס מאסטר Taq, בריכה מותאמת אישית Taq µL 3.75 ו 6.25 µL נוקלאז ללא מים, הנפח הכולל של 25 µL. לבצע התגובה הגברה מראש באמצעות התרמו-הצנטרפוגה בהתאם לפרופיל תרמי הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 ° צלזיוס למשך 2 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 12 מחזורי 95 ° C 15 s, ו- 60 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות , אז תחזיק ב 99.9 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס לדלל את המוצר על-ידי הוספת µL 175 של 0.1 X טה, pH 8.0. הערה: המוצר מדוללת יכולה להיות חנות ב-15 ל-20 ° C למשך לפחות שבוע. 6. RT-qPCR תגובה אישית Taq מערך MicroRNA כרטיסי שימוש microfluidicCustom 384-ובכן Taq מערך MicroRNA כרטיס כדי למדוד רמות פלזמה של 24 ספציפי miRNAs (, זוהו כפילויות) על דגימות 8 בו זמנית. מזהה MiRBase (v21) עבור miRNAs 24 הם: יש-מיר-101-3 p p יש-מיר-106a – 5p, יש-מיר-126-3, יש-מיר-133a – 3p, יש-מיר-140-3 p, p יש-מיר-140-5, יש-מיר-142-3 p, p יש-מיר-145-5, יש-מיר-148b – 3p, p יש-מיר – 15 ב- 5p, יש-מיר-16-5, p יש-מיר-17-5, יש-מיר-197-3 p p יש-מיר – 19 ב- 3p, יש-מיר-21-5, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-28-3 p, יש-מיר-30b – 5p, יש-מיר – 30c – 5p, יש-מיר-320a, יש-מיר-451a, יש-מיר-486-5 p, יש-מיר-660-5 p, יש-מיר-92a – 3 פ µL 1.13 תמהיל המדגם PreAmp מדולל עם µL 56.25 של 2 X מיקס מאסטר אוניברסלי Taq, µL 55.69 של נוקלאז ללא מים בצינור 0.5 mL- לטעון עד 8 תערובת התגובה PCR על הקלפים MicroRNA מותאם אישית מערך Taq. צנטריפוגה-311 g x עבור 2 דק. לאטום את הכרטיס מותאם אישית עם חותם כרטיס מערך. לרוץ בזמן אמת התגובה באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת שינוי הפרמטרים אופניים כדלהלן: 94.5 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי 97 ° C ל 30 s ו- C ° 59.7 60 ס 7. אקסטרפולציה של הנתונים ויצירת יחסי השתמש בתוכנה כדי לקבל ערכים Ct raw, הגדרה בסיסית אוטומטית כדי להסיר את האותות רקע וסף קבוע של 0.15 עבור כל מבחני ודוגמאות. להסיר כתמים עם הגברה המסכן עיקולים ו/או התייחסות פסיבית המסכן אותות. לייצא ערכים Ct raw ב- ". xls " לעצב ולהשתמש Ct אומר בערך הכפילויות שני לצורך ניתוח נוסף. MiRNAs לתאם ' רמות הביטוי למדידות ההיסטורי על מחקר קליני דגימות (טבלה 2). אם לפחות 50% של דוגמאות על כל כרטיס microfluidic תוצרת אישית לגרום פירסון ' s המתאם < 97.5, חזור על הכרטיס (QC2 טבלה 1). חישוב − ΔCts בין כל miRNAs, שוות-ערך לערכים log2 של היחסים miRNA. 8. הערכה של המוליזה על ידי miRNA נלווים חתימה צור חתימה miRNA הקשורות המוליזה באמצעות את היחס miRNA הבא עם חתך בהתאמה-offs (log2 ערכים) עבור אחסון קצר פלזמה דגימות (שבועות 1-5 − 80 ° C): miR-126/451 < − 0.07, 15 ב/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30 ב’/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0.33, p 15 ב/486-5 < − 3.86, 221/486-5 p < − p 30 ב’/486-5 3.17, < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15 ב/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30 ב’/92a < 0.87, 126/16 < − 2.85, 15 ב/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30 ב’/16 < − 3.68. Classify כדוגמאות hemolyzed שבו לפחות 50% של יחסי (8 מתוך 16) עולה על ניתוק בהתאמה (QC3 טבלה 1). 9. ההגדרה של רמת הסיכון: גבוהה, בינונית, נמוכה קבע ארבע חתימות של יחסי miRNA להלחין את MSC כפי שדווח באיור 3: הסיכון למחלות (RD), הסיכון למחלות אגרסיבי (RAD), נוכחות של המחלה (PD), נוכחות של מחלה אגרסיבית (PAD). עבור כל חתימה, מגדירים את היחס לחרוג מהערך ניתוק בהתאמה עבור אחסון קצר פלזמה דגימות (שבועות 1-5 − 80 ° C). המספר של העולה על יחסי צריכה להיחשב חיובי הוא 9 מתוך 27 עבור RD ו- PD, ו 14 מתוך 28 עבור ראד ובמשטח ( איור 3 א). מייחסים כל מדגם את רמת הסיכון MSC בהתאמה כדלקמן: נמוך הסיכון אם רואד neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; בסיכון בינוני אם רואד pos ∪ PD pos ∩ ראד neg ∩ PAD neg; או בסיכון גבוה אם רד pos ∪ PAD pos ( איור 3 ב).

Representative Results

המשפט BioMILD הוא מחקר פרוספקטיבי לגילוי מוקדם של סרטן ריאות במטרה בוחן את היעילות של גישה LDCT-MSC משולב כמו בדיקות סינון קו ראשון במדגם גדול של יחידים מעשנת כבדה. מחלקה של הסיכון מיוחס לכל מתנדב על סמך הבדיקה miRNA, אשר תוצאתו יחסי בין 24 פלזמה miRNAs במחזור. כפי שדווח במידה רבה30,31,32, המוליזה הוא נושא קריטי לניתוח של מחזורי miRNA, מאז תוצאות שווא יכול להתקבל בשל שחרור לא ספציפית של miRNAs על ידי כדוריות הדם. בתהליך מתודולוגי הצעת העבודה, פקד איכות מראש אנליטי צעד (QC1 טבלה1) כדי לזהות hemolyzed, ובכך שאינם-בקופסאת, תוארה דגימות פלסמה. איור 1 דוחות ניתוח spectrophotometric של hemolyzed (איור 1א’) ודוגמאות hemolyzed (איור 1B) פלזמה עם ערכים A414/A375 בהתאמה. בהקשר הקליני היו התוצאה של מבחן מולקולרי הוא קריטי לניהול התנדבות, QC1 הזה מאפשר חוזרות דגימה דם ושחזור, ברוב המקרים, את הדגימה. לאחר עיבוד מולקולרית, הביצועים RT-qPCR יש בצורה מדויקת להעריך באופן כדי לזהות בעיות טכניות. איור 2 א מראה RT-qPCR עם הופעה נמוך עקב אות התייחסות פסיבית המסכן. במקרה זה טוען מחדש את המוצר הגברה מראש כרטיס microfluidic חדש מומלץ. RT-qPCR מבצע, כמו באיור 2B, הכרטיס ממשיך לשלב בקרת איכות אנליטי פוסט הראשון כדי להבטיח כי הערכים בביטוי miRNA דומה עם המדידה ההיסטורית (QC2 טבלה1). אם הצעד QC2 נכשל, ייתכן שאירעה בעיה טכנית במהלך שעתוק במהופך, או בתגובות של קדם הגברה, זה נוח לחזור עיבוד המולקולרי כולו החל משעתוק במהופך. השלב האחרון של בקרת איכות (QC3 טבלה1) מוערך של המוליזה גם ברמה המולקולרית. רמות הביטוי של 4 miRNAs ספציפיים כדוריות דם אדומות (מיר-16, מיר-451, מיר-486-5 p ומיר-92a) הושוו לאלה של 4 המוליזה שאינם קשורים miRNAs (מיר-126, מיר-15 ב, מיר-221 ו mir-30b), יצירת החתימה miRNA הקשורות המוליזה שהלחין 16 (4 x 4) יחסי miRNA. דוגמאות חיוביות מסווגים כפי hemolyzed, בעוד דוגמאות שליליות להמשיך MSC הסיכון רמת המיון האחרון כפי שמתואר פרוטוקול בסעיף 9 ואיור 3. איור 1: ניתוח spectrophotometric של דגימות פלסמה טריים. פרופילים spectrophotometric של (א) 2 hemolyzed, דגימות פלסמה hemolyzed 2 (B), מדידת היחס ספיגת בין אורכי גל A414 ו A375. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : RT-qPCR ביצועים ב- microfluidic כרטיסי ניתוח. הגברה, multicomponent חלקות המסכן משווה (A) וכרטיסי microfluidic באיכות טובה (B). כל miRNAs 24 ו- miRNA exemplifying יחיד מדווחים על כל לוח. החלקות ל ממחישים את האותות התייחסות פסיבית המתרחשים תגובות אלו RT-qPCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: MSC אלגוריתם עבור הסיכון ריבוד. התוצאות נציג בהתחשב פלזמה 6, דגימות מתנדבים נרשם BioMILD הקרנת המשפט. (A) של miRNA-יחסי חתימות של הסיכון למחלות (RD), הסיכון למחלות אגרסיבי (RAD), נוכחות של מחלה (PD), נוכחות של מחלה אגרסיבית (PAD), והערכים התואמים ניתוק (log2) עבור דגימות פלסמה המאוחסנים ב- 80 ° C עבור לפחות שבוע 1 עד 5 שבועות. (B) שילוב החתימות ארבע כדי stratify דגימות בקופסאת גבוה (H), בינוני (I), MSC (L) נמוך לסכן את רמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

החסרונות ואתגרים של זרימת העבודה מתודולוגיים
כמו BioMILD במחקר פרוספקטיבי הראשון ניתוח miRNAs במחזור ככלי אבחוני, ספי, גזור-offs מנוצל עבור ניתוח נתונים נוצרו מתוך סדרת רטרוספקטיבי. כדי להתגבר על הבעיה מרווח האחסון השונים של דגימות פלסמה, הפרמטרים יכול להיות מעודן כדי אולי להשיג עלייה של הביצועים MSC. ובכל זאת, לפני שמתחילים miRNAs ניתוח, מספר היבטים של תהליך הכולל צורך בזהירות להעריך, כגון לקריטריוני ההכללה, איסוף הדגימה, עיבוד, ואימץ האלגוריתם ביואינפורמטיקה לניתוח נתונים. הסעיפים הבאים יתמקד רוב הנקודות קריטית של זרימת העבודה המתוארת בעלון המאמר הנוכחי, בנושא מרכזי בכל צעד בודד, ואז מציע אסטרטגיות להתגבר עליהם.

אוכלוסיית המחקר
הרשמה לקריטריונים BioMILD הקרנת המשפט הם: 50-75 שנים מעשנים לשעבר (פחות מ- 10 שנים) העתיקה, כבד עם חבילת לפחות 30-שנה ולא היסטוריה מוקדמת של סרטן בתוך 5 שנים. באוכלוסיה זו, שכיחות סרטן הריאה מוערך השכיחות בשנה היו כ- 1% ו- 0.7%, בהתאמה. כדי להחיל את המבחן MSC כפי שמתואר הפרוטוקול המוצע, האוכלוסייה ניתח צריך לשמור על מאפיינים דומים. בפרט, השלב QC2 המתואר לעיל כוללת השוואה עם הנתונים ההיסטוריים נתון המתקבל אוכלוסיה דומה. בעוד מתאם מתחת 97.5 יכול להיות מרמז על בעיות טכניות, מצד שני, רוב האנשים עם רמות miRNA מחזורי שינו המשקף את הסיכון בסרטן ריאות הן למעשה מתחת לסף זה. במילים אחרות, אם הצעד QC2 עם הפרמטרים דיווחו כאן מוחל על אוכלוסיה בסיכון גבוה יותר לפתח סרטן ריאות, זה עשוי לכלול דוגמאות מקובל. פרמטרים חדשים, כמו שצריך הפניה צריך ואז להיות מוגדרים ספציפיות עבור כל האוכלוסייה נותחו על פי התוצאות הצפויות.

איסוף דם והמוליזה
האוסף של דגימות ביולוגיות הוא אנליטי מראש צעד מכריע, שכן זה עלול לפגום באיכות הדגימה ומאפיינים, ובכך לשנות את התוצאות הסופיות של ניתוח. לגבי דגימות דם, חשוב לאסוף דם טרי ולעבד את הדגימה מהר ככל האפשר. דוגמאות להיות לא מאוחסנים ב 4 ° C ‘ ולא ‘ קפוא לאחר נסיגת דם, שכן הקפאה והפשרה קטעים של עשוי לגרום פירוק התא (המוליזה) והשפלה RNA. כדי למזער את תהליך המוליזה, הוא הציע להפריד פלזמה בתוך 2 h דם אוסף31 .

המוליזה היא בעיקר בשל פירוק של כדוריות דם אדומות (RBCs) ושחרור הסוגר של התוכן שלהם מהסביבה הסובבת. זה יכול להיות בעיה במחזור miRNAs בדיקות כי שחרורו של תוכן תאיים RBCs הפיצולים באופן דרמטי את הפרופיל microRNA בדם, פוטנציאל להשפיע על הדיוק של ניתוח המבוסס על פלזמה30.

כדי שלא יוכלו לזהות גם רמות מינימלי של המוליזה בדגימות הפלסמה חיוני ללימודים מבוסס על מחזורי miRNAs כמו סמנים ביולוגיים. המוליזה ניתן בתחילה להיות מוערך על ידי בדיקה ויזואלית, מאז אחרי שני צעדים צנטריפוגה שהצבע של פלזמה שיכול לנוע בין צהוב אדום עבור דגימות hemolyzed מאוד. עם זאת, בדיקה ויזואלית בלבד לא ניתן מספיק רגיש בהקשר של מחקר סמן מולקולרי.

שיטה פשוטה, אנליטי מראש לזהות דגימות פלסמה hemolyzed הוא המדד spectrophotometric-גל (λ) = 414 nm של ספיגת שיא הראשי oxyhemoglobin, לאחר השינוי המתאים עבור כל מקור אחר של הפרעה. מסיבה זו, אנו מנורמל הפסגה 414 nm לערך ספיגת-375 nm, מעידה על תוכן lipidic33. לחלופין, או יותר טוב, בשילוב, ניקוד lipemia-independenthemolysis (HS) יכול להיות בשימוש34. נוהל זה מבוסס-spectrophotometrically ניתן לזהות לפחות 6.1 mg/dL של המוגלובין חינם. אחרת, ניתן לזהות דגימות hemolyzed דרך זיהוי miRNAs ספציפיים כדוריות דם אדומות. מאז אפילו אחוז נמוך מאוד של המוליזה יכול להפיק גידול משמעותי במספר רמות כדוריות דם אדומות ספציפי miRNA32, פורטונאטו. ואח מזוהה חתימה הקשורות המוליזה ספציפי המבוסס על יחסי-miRNAs 16 יכול ביעילות לסווג המוליזה ב פלזמה דגימות33. כל מבחני שהוזכרו עשוי לשמש בשילוב מאז היחס ספיגת 414/375 ו/או HS הם אימצו בשלב טרום אנליטי חיסכון בעלויות נוספות, ואילו מדידה הקשורות המוליזה miRNAs יכול לשמש בשלב שלאחר אנליטי כפקד איכות שלב.

במחזור miRNAs בידוד וטוהר RNA
החילוץ הליך ה-RNA היא צעד השפעה רבה על ההצלחה של הניתוחים הבאים. החל ממדגם קלט נמוכה, כמו פלזמה, חילוץ צריכה להיות יעילה ככל שניתן על מנת להבטיח של כימות מדויק של miRNAs. פלזמה מאופיין על ידי ריכוז גבוה של חלבונים רבים, כולל nucleases ורכיבים אחרים אשר יכולים להפריע תגובות אנזימטיות במורד הזרם של RT-qPCR עלול להשפיע על זיהוי miRNAs במחזור. מספר שיטות החילוץ השתמשו בסוגים אלה של מחקרים, אבל באופן כללי, חילוץ אורגני ואחריו מבוסס-סיליקה העשרה RNA מאפשר הסרת פלזמה מעכבי יותר ואז לבד TRIzol35. יחד עם זאת, בשנים האחרונות, הוצאה ידנית הוחלף החילוץ אוטומטית. הסיכון מינור של זיהום, הפארמצבטית גבוה יותר את השימוש הכלכלי זמן הם היתרונות העיקריים של מערכות אוטומטיות לעומת הבידוד ידנית פרוטוקולים. יתר על כן, בשיטות אוטומטיות שאיבת הניב הכמויות miRNA הגבוהה של דגימות דם ואת היעילות הגבוהה ביותר בהשוואה פרוטוקולים ידנית36.

נורמליזציה בנושא
נורמליזציה של רמות miRNA פלזמה היא עדיין נושא שנוי במחלוקת. אכן, הבדלים מדגם האיכות או הכמות יכולים להפריע זיהוי נכון לשינויים רמות הביטוי miRNAs הנגרמת על ידי נוכחות או הסיכון של מחלות, ובכך שמוביל פרשנויות נתונים חד משמעיים, מטעה מסקנות. עד כה, חוסר הסכמה הביא לנרמול שונים אסטרטגיות37.

רנ א הכולל שחולצו מן הדגימות פלזמה היא בדרך כלל מתחת לסף של שיטות כימות סטנדרטיים כגון ספקטרופוטומטר UV או מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרופוטומטר, ובכך מסלק RNA סטנדרטיזציה המוני38. כתוצאה מכך, אמצעי אחסון קבוע ולא כמות קבועה של eluted RNA צריך להיבחר כקלט עבור התגובה RT39.

ניהול משק בית תעתיקים המשמש לניתוח miRNA ב דגימות רקמה, כמו RNU48 ו- RNU6, אינם מתאימים עבור נרמול מדידות miRNA חוץ-תאית, שניהם אינם תמיד לזיהוי במחזור, עקב בתיווך RNase השפלה40, הם גם deregulated ב מחלות ספציפיות באופן37. לא ברור אם כל miRNAs במחזור ביעילות יכול לשמש כפקדי הפניה. לדוגמה, מיר-16 לעתים קרובות מוצע עבור משק הבית, אך dהציפס מחקרים הראו כי זה הוא deregulated בדגימות הפלסמה של סרטן המטופלים28,37. יתר על כן, מיר-16 רמות מאוד מושפעים המוליזה30.

בעוד עבור תפוקה גבוהה מבחני מדידת מספר miRNAs, נורמליזציה על ערך הביטוי רשע הוא מקובלים41, כאשר מספר מוגבל של miRNAs צריך להיות מנותח, לא ניתן ליישם גישה זו נורמליזציה. כדי לעקוף את הבעיה נורמליזציה, Boeri. ואח הקים בעבר אלגוריתם מבוסס על יחסי הגומלין בין 24 miRNAs28. גישה כזו, למרות היותו מאוד שימושי עבור הפיתוח של כלי האבחון, לא בקלות מאפשר הבחנה ביעילות משתנה miRNAs ואולי יש תפקיד בהתפתחות הגידול, ולכן זיהוי miRNAs כמו כיילים מתפקדת. אסטרטגיה יעילה נוספת, שאומצה על ידי הקבוצה של ביאנקי. ואח שהתפתח סרום מיר-בדיקה לגילוי מוקדם של סרטן ריאות, התבססה על נורמליזציה על הממוצע הגאומטרי של קבוצה של 6 “משק סרום-miRNAs” משתנה פחות בין דגימות ו שיעורים של חולים42.

תכונות של miRNA נוזלי ביופסיה ומבוססי -פוטנציאל היישום
MSC מבוססות פלזמה היא בדיקה לא פולשנית מולקולרית לימודי אבחון מוקדם של סרטן ריאות אצל מעשנים כבדים. הבדיקה MSC יכולים לזהות נושאים ביניים או בסיכון גבוה לפני אבחון סרטן ריאות על ידי LDCT, עם רגישות גבוהה (SE, 87%), ערך ניבוי שלילי (NPV, 99%). באופן ספציפי, MSC יכול ליישם ההקרנה LDCT על-ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות 3.7%, מ- 19.7% עבור LDCT לבד29. הבדיקה MSC הראו גם יש הרבה ביצועים טובים prognostic כאשר בוחנים רק ריאות חולי סרטן, יכול לשמש ככלי לניטור לבד או בשילוב עם פרמטרים פתולוגיים קליניים אחרים,43,44. באופן פוטנציאלי, הבדיקה MSC עשוי לאפשר יותר עקביות של ריאות סרטן אבחון אלגוריתמים, ובכך להקטין את ההקרנה משתלמת.

מלבד MSC, דווחו פולשני בדיקות לגילוי מוקדם של סרטן ריאות. ביאנקי ואח. הציע מבחן מיר במחזור בהתבסס על החתימה 34-miRNA45, ולאחר מכן למצב זה חתימה 13 miRNA42. Fordiscovery הדוגמאות סרום ובדיקת התקבלו מ רציף התצפית של עישון נושאים (היקום) LDCT הקרנת המשפט, ביצע אירופה מוסד לאונקולוגיה (IEO, מילאנו, איטליה). MiR-הבדיקה הראתה 78% דיוק לגילוי סרטן ריאות מתנדבים בסיכון גבוה. בין את הנסיוב-miRNAs 13 ו-24 להלחין את MSC, רק 5 miRNAs היו חופפים (מיר-92a, מיר-30b, מיר – 30c, מיר-148a ו- p מיר-140-5). זה יכול להיות בשל סוג שונה של החל דגימות (נסיוב נגד פלזמה) וכדי לפתח נתונים. למעשה, עבור הבדיקה-מיר, מחברים נבחרים 6 miRNAs מתנהג כמו משק בנסיוב, ששלושה מהם נכללו גם בקרב היחס miRNA MSC (מיר-15 ב מיר-19 ב, מיר-197). ובכל זאת, את MSC בפלסמה, מיר-לבדוק את הדוגמאות סרום יותר עמוקות לאמת את השימוש מבוססי miRNA ביופסיה נוזלי גילוי של סרטן ריאות.

MiRNAs פרופיל לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים לסרטן ריאות בוצע גם דגימות sputum46. ברוק ניתן לאסוף בקלות ומופיעות רמות הביטוי miRNA להיות מאד יציב בו. עם זאת, מתנדבים הקרנת סרטן ריאות שגילם 50-55 והם מעשנים כבדים עם morbidities שיתוף כגון COPD, ובכך sputum קשה להשיג. אכן, בין נוזלי הגוף השונים, פלזמה היא אחת החלופות הטובה ביותר לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של miRNAs כמו (אך לא רק) סמנים ביולוגיים לסרטן ריאות.

בסך הכל, ההליך המתואר בסעיף המאמר הנוכחי יכול להיות רלוונטיים בהקשר של מחלות שונות, עם כל הגבלה בסוג של פתולוגיה חקר (מסרטן, מערכת העצבים, מחלות לב וכלי דם או סוכרת), המטרה של שימוש קליני (סמן לצורך אבחון, פרוגנוזה או אפילו התגובה לטיפול).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים תודה פאולה Suatoni, אלנה Bertocchi, קרולינה Ninni, אנאמריה Calanca, ומשמש קיארה מבציר לטיפול בניסויים, לסיוע מינהלי; קלאודיו Jacomelli, קלאודיו קיטריו עבור ניהול נתונים. העבודה נתמך על ידי האגודה האיטלקית לחקר הסרטן [לחוקר מס 15928 למעלה, 14318 GS ולאחר 12162 (תכנית מיוחדת “כלים חדשניים להערכת הסיכון לסרטן של אבחון מוקדם,” 5 x 1000)]; איטלקי משרד הבריאות [מענק מס RF-2010]; הענק UO1 CA166905 מן המכון הלאומי לסרטן (ארה ב). מגה נתמכה על ידי מלגת Pezcoller דל’אנג’לו.

Materials

 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).

Tags

Liquid BiopsyPlasma MiRNALung Cancer ScreeningMicroRNA SignatureEarly DetectionTumor MicroenvironmentRNA IsolationQPCRMolecular Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image