Устные биопленки выборки для анализа микрофлора в здоровых детей
Summary
Растущий интерес, являются изменения в устной микрофлора на протяжении всего детства. Сравнение различных микрофлора исследований показывает отсутствие выборки стандартизированных протоколов. Ограниченное пространство делает выборки звук поддесневых борозды детей сложной. Бумага точки выборки здесь представлены в деталях как метод выбора для этой области.
Abstract
Устные биопленки и ее молекулярный анализ является основой для расследования различных стоматологических исследований и клинические вопросы. Знание биопленки состава приводит к лучшему пониманию механизмов кариесогенных и periopathogenic. Микробные изменения, происходящие в ротовой полости в детстве представляют интерес для нескольким причинам. Эволюция ребенка устное микрофлору и изменения в его составе должны далее проанализированы, чтобы понять и возможно предотвратить развитие заболеваний. В то же время необходимы передовые знания естественного состава устные биопленки. Ранних стадиях свободных кариеса постоянных зубов с здоровых десен обеспечивают широко неизменным поддесневых Хабитат, который может служить в качестве базовых в месте для изучения особенностей здоровья полости рта и болезни. Таким образом, анализ устных биопленки детей во время различных этапов жизни является важной темой в области. Современные молекулярный анализ методы могут дать исчерпывающую информацию о бактериальных разнообразие таких биопленки. Чтобы включить сравнение данных микробиоты, важно стандартизировать каждый шаг в процедуре для создания молекулярных данных. Эта процедура охватывает от клинических проб, следующего поколения виртуализации (НГС), bioinformatic обработки данных, таксономический толкования. Одним из наиболее важных факторов здесь является биопленки выборки. Выборка в детей является еще более сложным, в частности из-за ограниченного пространства в поддесневой области. Таким образом, мы сосредоточены на использование бумаги точек для поддесневых выборки. Эта статья содержит подробный протокол для отбора проб устные биопленки поддесневых борозды, слизистой оболочки и слюны у детей.
Introduction
Человека устные биопленки состоит из широкого сообщества, состоящая в основном из Комменсалами и полезных микроорганизмов в1,2,3. Обитающих здесь колонизировать все ниши, что полости предлагает4,5,6. Состав биопленки в этих нишах меняется как широко, как среды обитания. Слюна например отображает различные бактериальные профили чем доска образцы. В образцах налета здоровых взрослых относительное обилие актиномицеты составляет более 20%, в то время как менее 7% находится в слюне. Bacteroidetes и Фирмикуты в отличие от появляются в гораздо более высоких чисел в слюне7. Таким образом важно для выборки в разных местах в рот для того чтобы получить всю картину. Кроме того различные факторы, такие, как географические и этнические различия, возраста, пола и многие другие факторы затрудняют определить общие правила для биопленки развития и болезней начала8,9. На протяжении многих лет расследования periopathogenic и кариесогенных биопленки был центральной задачей8,10,11,12,13.
В последние годы исследования на здоровых испытуемых приобрел важное значение не только для более широкого понимания болезней, но и для осуществления профилактических мер14. Новые технологии молекулярного анализа дальнейшие устные биопленки и функция,1516и включить полное профилирование микробного разнообразия17,18. Это должно также привести к новому пониманию микробной изменений во время ортодонтического лечения19. Влияние на развитие ортодонтических биоматериалов предсказуемым. Расширение перспективы будет проливают новый свет на осложнения ортодонтические терапии, связанных с биопленки, например деминерализации эмали и заболеваний пародонта12,,2021. Чтобы разрешить во всем мире данных сопоставлений, важно стандартизировать все шаги в генерации данных. Незначительные изменения в процедурах лабораторных могут сильно повлиять на результаты. Кроме того использование различных вычислительных платформ обработки данных может привести к не сопоставимые наборы данных. Наконец выбор статистических тестов и исправления имеет влияние на результаты. Однако смещения выборки может произойти уже задолго до любой работы лаборатории или био компьютинг начинается. Методы нестандартизированного выборки приводят к изначально предвзятым исследования. Ввиду низкого до умеренного уровня стандартизации в соответствующих исследованиях существует мало доказательств о связи между ортодонтии и microbiomes19. Таким образом разработка стандартизированных методов облегчит квалифицированных сравнение данных в поле.
Эта статья представляет стандартизированные устные биопленки процедуры отбора проб. Протокол призван способствовать генерации глобально сопоставимые коллекции микроорганизмов последовательности данных. Представлен пошаговый протокол для выборки устные биопленки в здоровых детей. Как метод выбора бумаги точки являются вставленных atraumatically в звук поддесневых борозды. Для облегчения сравнения Хабитат, слизистой щек выборку согласно такой же протокол. Кроме того, эта статья демонстрирует параллельных и объединенные выборки. Кроме того показано проб слюны. Простым цветом, транспорта и системы хранения также представил, облегчения управления образца для дальнейшей обработки. Выбор течению операций относительно среды хранения, метагеномных анализ и биоинформатики зависит от клинической вопросы, поднятые в различных областях в устных исследований. В этой рукописи проб ДНК для NGS был выбран в качестве примера возможного применения для ортодонтического исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бактерии находятся на всех объектах в пределах ротовой полости24,25,26. Многие исследования были сосредоточены на использовании слюны как средство отбора проб для сопоставления устные колонизации, как он может быть легко пробы через плевки27,28,29,,3031, 32. Однако слюнных биопленки не отражает состав поддесневой биопленки. Таким образом использование других методов выборки имеет решающее значение для создания общей картины и вызовут новые обсуждения в стоматологических исследований. Несколько статей сравнить использование кюретки и бумаги точек отбора поддесневых periodontally больные темы8,,3334. Тем не менее не исследовательская группа известна сосредоточились на применение стандартизированных выборки устройств для различных возрастных групп, особенно для детей19.
В этом видео представлен устный биопленки выборки три устных местообитаний в здоровых детей.
Модификации и устранения неполадок:
Цель рукописи фокусируется на клинический протокол для выборки поддесневой биопленки здоровых детей. Метод выбора означает звук поддесневых борозд, где ограниченное пространство делает выборки особенно сложной. В этом видео метод был применен к ранней постоянных зубов. Может также применяться, смешанные или зрелых зубочелюстной системы, а также детей или взрослых. Наш метод выборки позволяет для модификации, такие как одинарные или объединения образцов. Последний может стать решающим фактором для молекулярного анализа из-за малого количества ДНК коллекционные от здоровых поддесневых борозды. Выбор индекса зубов могут быть изменены по требованию; в частности еще один зуб может быть пробы в качестве альтернативы когда эпителий травмированным и кровотечение, таким образом делая точки бумаги непригодным для использования. Параллельных проб с использованием двух точек бумаги одновременно на одном сайте делает пример реплицирует в один шаг, помимо сокращения времени кресло для детей.
С небольшими изменениями можно отведать больной пародонтальных карманов. Здесь точки бумаги нужно будет включить полную длину кармана, который может достигать до 10 мм. Длина и конус бумаги точек, а также глубина вставки должны быть адаптированы к интраоральные Хабитат интерес, но всегда должны быть стандартизированы, материал и размеры. Образцы также могут быть приняты из слизистой оболочки, с использованием бумаги точек. Одинаковые протоколы позволяют сравнения различных устных местообитаний и различных стоматологических материалов. Подготовка пациента и хранения проб могут выполняться как описано в этом видео. Для metatranscriptome исследований РНК могут отбираться с тем же методом. Таким образом после выборки, бумажные очки следует вставить непосредственно в РНК стабилизация решения.
Ограничения метода:
Независимо от того изменения метод клинических проб, которые мы опишем ограничивается звук поддесневых борозды. Других участков отбора проб, как пример periodontally больной карманы, не являются частью нашего дизайна исследования. Как заказ выборки на полную глубину таких очагов, бумага точки не могут быть достаточно большим, чтобы собирать образцы достаточно. Если экспериментальной цель сравнить данные брались звук поддесневых борозд и periodontally больной карманов, важно учитывать присущие предвзятости, который связан с различных клинических проб методами. Поэтому не рекомендуется для сравнения таких данных.
Ограничения метода здесь представлены выборки без последующего использования пропидий monoazide. Добавив этот агент непосредственно после выборки позволяет для конкретного анализа только живых клеток проанализирована биопленки. Метод выборки, в описанный здесь отражает количество живых и мертвых клеток. Для исследования серьезный периодонтит бумажные очки будут вероятно нужно быть заменены кюретки, как биопленки в глубокие карманы является сильным. Бумага точки выборки может не отражать весь спектр микроорганизмов в таких случаях, как их поверхность может быть насыщенным слишком быстро.
Значение в отношении существующих методов:
Предлагаемый рукопись является первым в своем роде стандартизировать поддесневых выборки в здоровые борозды с бумажным штифтом. Другие доклады касались использования металлических кюретки35,36 или бумаги очка 37,,3839, но не описывают процессы, которые происходят до отбора проб, такие как доска управления, чистки зубов, зуб изоляции и сушки а также процессы, результатом неадекватные спецификации на линии выборки техника и время.
В двух предыдущих статьях мы показываем, что бумаги точек используется воспроизводимый метод отбора поддесневой биопленки в детей22,40. Благодаря их конструкции кюретки являются слишком большими для неглубокие борозды с ограниченным пространством и слишком острый для тендера соединительной эпителия. Важно, для доступа к поддесневых борозды без травмирующих эпителия. Таким образом избежать предвзятости, возникающие от кровотечения. Таким образом использование точек тонкая и нежная бумага является предпочтительным для этой области. Бумага точки являются функциональными для мониторинга изменений в составе биопленки во время ортодонтического лечения21,41. Они являются тонкий и достаточно гибкими, чтобы соответствовать между элементами несъёмные ортодонтические аппараты. Это большое преимущество для других методов отбора проб, как кюретки. Атравматический выборки является упрощенной и выборки небольшое количество ДНК Возможен экспорт.
Будущих приложений:
В этом видео мы продемонстрировали метод не больной, ранние, постоянных зубов. Он также может применяться для смешанного или Зрелые зубочелюстной системы. С некоторыми коррективами, можно попробовать periodontally больной сайты, как зубы или имплантаты и другие ниши, из-за стоматологические материалы, следуя тот же протокол. Кариес исследования могли воспользоваться этой стандартизованного протокола, в частности исследований на корень кариеса. Наиболее важным лекция от нашей выборки видео является стандартизации протоколов сделать сопоставимыми, независимо от того, что и как измеряются образцы данных.Будущего видео демонстрации может расширить поле клинических проб в целом.
Устные биопленки, как показано в видео используется в клиниках и для научных исследований. Этот подход в естественных условиях представляет собой хорошее дополнение в vitro молекулярные методы, такие как флуоресценции в situ Гибридизация и конфокальный лазерной сканирующей микроскопии15. NGS методы, как пиросеквенирования, показанный здесь, применяется к собранной биопленки, позволяют проводить анализ полного микробиоты. Расчета относительного обилия видов бактерий может использоваться для поддержки лечения или для сравнения различных пациентов или различных методов лечения. Вместе со стандартной последовательности протокол последовательность анализа рабочего процесса и что у нас есть ранее описанных40, этот метод выборки позволяет анализ последовательности до уровня рода. Далее «мета»-исследования, такие, как metatranscriptomic или Метаболомные исследования возможны на основании протокол выборки, в этом видео.
Важнейшие шаги:
Предотвращение загрязнения является важнейшим шагом: стерильные инструменты должны применяться в среде-нестерильная в естественных условиях . Передача от рта к скамейке должна быть выполнена быстро и надежно опытных экзаменатором держать стул время для участников исследования как можно более коротким. Наиболее важным этапом в протоколе является атравматической вставки точки бумаги в поддесневой борозды. Нарушение соединительной эпителия и кровотечение абсолютно необходимо избегать. Дальнейшее обслуживание должно быть принято для того, чтобы не загрязнить бумаги точек и хранения флаконы с экзогенной ДНК или РНК. Хранения затем также является важным шагом. Образцы должны быть заморожены непосредственно, в лучшем случае на −80 ° C. Это позволяет избежать изменения в состав бактериальной пост выборки, которая будет фальсифицировать результаты секвенирования.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признательны за отличную техническую помощь в видео-продукции и Моника Фаррелл (управления научными исследованиями, медицинский университет в Граце) как голос талант Йоахим Theussl (центр медицинских исследований, медицинский университет в Граце).
Materials
| Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
| GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
| Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
| Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
| tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
| micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
| ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
| Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
| tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
| cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |
References
- Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).
- Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
- Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).
- Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy ‘core microbiome’ of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).
- Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).
- Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
- Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).
- Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).
- Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).
- Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
- Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).
- Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the ‘red complex’, a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
- Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).
- Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. , e2967 (2011).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. , (2016).
- Kilian, M., et al. The oral microbiome – an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).
- Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).
- De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).
- Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).
- Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat?. Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).
- Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
- Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
- Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).
- Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5 (2), e9321 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).
- Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. , (2014).
- Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. , e50815 (2013).
- Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).
- Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).
- Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).
- Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. , e4108 (2012).
- Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).
- Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).
- Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).
- Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).
- Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).
- Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7 (8), e41606 (2012).
- Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
- Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).
- Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).
