Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Анализ функции гена обычно включает фенотипические сравнение между одичал тип деформации и напряжения, в котором было нарушено определенного гена интереса. Этот ген нарушение техника была использована для анализа функции гена в широком диапазоне таксонов, от бактерий до млекопитающих. Ген нарушение конструкция необходима для поколения штамма ген нарушена; Эта конструкция дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) состоит из гена маркер антибиотикорезистентности, сливается в верхнем и нижнем течении, окаймляющие регионов целевого гена и включена в геноме через гомологичная рекомбинация. Джин нарушена деформации могут быть изолированы с помощью селективного носителей, содержащих антибиотик. Обычные метод, используемый для строительства ген нарушена штамм требует сложных шагов, таких как амплификация гена целевой полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигирование гена в подходящей плазмиду, пищеварение с ограничением ферменты и religation чтобы вставить маркер антибиотик сопротивление гена. Этот процесс является длительным, принимая несколько дней до нескольких недель, в зависимости от успеха каждого шага. Кроме того дизайн разрушение конструкции зависит энзима ограничения сайтов целевого гена. Для решения этих вопросов, были зарегистрированы на основе ПЦР ДНК сплайсинга методы^1,2 для проектирования ген нарушена мутантов сапротрофные discoideum³ и Synechocystis sp. PCC6803⁴ . В настоящем исследовании был разработан метод для создания Джин нарушена стрептококков штамм относительно быстрое, легким и недорогим способом, используя измененный метод на основе ПЦР (обозначено сплавливание 2-шаг ПЦР) для строительства нарушения Конструкция и электропорации для генетической трансформации.

2-шаг-фьюжн, PCR требует геномной ДНК, маркер генов антибиотикорезистентности как шаблон ПЦР и четыре пары надлежащим образом разработаны праймеры олигонуклеотида. На первом шаге (1^st ПЦР), 1-КБ вверх по течению фланкируя региона целевого гена, 1-КБ течению фланкируя область целевого гена и Джин антибиотик сопротивление маркер усиливаются методом ПЦР. 5′ регионов обратный грунт и вперед грунтовка для усиления вверх и вниз по течению фланговые регионов, соответственно, включают в себя 15 баз дополняет концы гена маркер. 5′ регионов прямого и обратного Праймеры для амплификации генов маркер аналогичным образом включают 15 баз в дополнение к нижней части вверх по течению фланкируя региона целевого гена и верхний конец области течению фланкируя целевого гена, соответственно. Таким образом три усиливается фрагменты содержат перекрывающиеся области 30-пар на сайте фьюжн. На втором этапе (2^nd ПЦР) ПЦР проводится с вложенными праймеры PCR, с использованием трех фрагментов, усиливается 1^st PCR как шаблоны. Дополнительно взаимодополняющих регионах шаблоны связаны друг с другом через 2^nd ПЦР. Наконец конструкции для гомологичная рекомбинация вводится одичал тип деформации электропорации. Успешное гена нарушения могут быть проверены с помощью конкретных праймеры PCR. Хотя нарушение конструкция усиливается с помощью высокоточных ДНК-полимеразы, дополнительные ферментативных реакций, таких как перешнуровка дна или ДНК пищеварение, не являются необходимыми для создания конструкции. Кроме того удаленные или консервированные региона на геном может гибко выбираться по конструкции праймера.

В настоящей работе удаление всего кодирвоания gtfC ген, который кодирует glucosyltransferase в Streptococcus mutans, была исполнена продемонстрировать метод срыв быстрое, легко гена в стрептококков видов. Кроме того, gtfB-нарушена штамм был создан в том же порядке. Glucosyltransferases, кодируются как gtfC , так и gtfB способствуют кариесогенных Стоматологическая биопленки развития^5,6. Биопленки формирование способности одичал тип деформации (S. mutans WT), gtfC-нарушена штамм (S. mutans ΔgtfC) и gtfB-были оценены нарушается штамм (S. mutans ΔgtfB) для сравнительного анализа фенотипические. Этот протокол расширяет применение двухэтапный метод срыв гена для дополнительных видов и могут быть изменены для исследования функции гена в более широкий спектр таксонов.