Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Gene functie analyse betekent meestal dat een fenotypische vergelijking tussen een wild-type stam en een stam die een bepaald gen van belang heeft is verstoord. Deze verstoring van de gen techniek is gebruikt voor gene functie analyses in een breed scala van taxa, van bacteriën tot zoogdieren. De constructie van een gen-verstoring is noodzakelijk voor de generatie van de gen-verstoord stam; Deze constructie deoxyribonucleic acid (DNA) bestaat uit de antibioticaresistentie marker gene gesmolten aan de upstream- en downstream flankerende gebieden van het target-gen, en is opgenomen in het genoom via homologe recombinatie. De stam van gen-verstoord kan worden geïsoleerd met behulp van selectieve media met het antibioticum. De conventionele methode gebruikt voor de bouw van de gen-verstoord stam vereist complexe stappen, zoals de versterking van het target-gen door de polymerase-kettingreactie (PCR), Afbinding van het gen in een geschikte plasmide, spijsvertering met beperking enzymen en regeling te voegen van het antibioticum-resistentie marker-gen. Dit proces is tijdrovend, het nemen van enkele dagen tot enkele weken, afhankelijk van het succes van elke stap. Het ontwerp van verstoring constructies is bovendien afhankelijk van de restrictie-enzym-sites van de target-gen. U kunt deze problemen oplossen, zijn PCR-gebaseerde DNA splicing methoden^1,2 voor het ontwerp van gen-verstoord mutanten van Dictyostelium discoideum³ en Synechocystis sp. PCC6803⁴ gemeld. In de huidige studie, een methode ontwikkeld voor het genereren van een gen-verstoord streptokokken stam in een relatief snelle, facile en goedkope manier, gebruik makend van een gemodificeerde PCR-gebaseerde methode (aangewezen 2-step fusion PCR) voor de bouw van de verstoring Construct en electroporation voor genetische transformatie.

De fusie van de 2-step die PCR genomic DNA, de resistentie tegen antibiotica marker gene als een PCR-sjabloon en vier paar op de juiste wijze vereist ontworpen oligonucleotide inleidingen. In de eerste stap (1^st PCR), een 1-kb upstream begeleidende regio van het target-gen, een stroomafwaartse begeleidende regio 1-kb van het doel worden-gen, en het antibioticum-resistentie marker-gen versterkt door PCR. De 5′ regio’s zowel de omgekeerde primer en de voorwaartse primer, voor versterking van de upstream en downstream bevatten flankerende gebieden, respectievelijk 15 honken complementair aan de uiteinden van het marker-gen. De 5′ regio’s zowel voorwaartse als terugwaartse inleidingen voor marker gene amplificatie omvatten ook 15 honken complementair aan het ondereinde van de upstream begeleidende regio van het target-gen en de bovenkant van de stroomafwaartse begeleidende regio van het target-gen, respectievelijk. Dus bevatten de drie versterkte fragmenten overlappende 30-basenpaar regio’s op de site van de fusie. In de tweede stap (2^nd PCR), wordt PCR uitgevoerd met genestelde PCR inleidingen met behulp van de drie fragmenten versterkt door de 1^st PCR als sjablonen. De complementaire regio’s van de sjablonen zijn bovendien aan elkaar gekoppeld via de 2^nd PCR. Tot slot, de constructie voor homologe recombinatie is geïntroduceerd in de stam van de wild-type door electroporation. Verstoring van de succesvolle gen kan worden geverifieerd door PCR met behulp van specifieke primers. Hoewel de structuur van de verstoring wordt versterkt met behulp van HiFi-polymerase van DNA, zijn extra enzymatische reacties, zoals DNA afbinding of spijsvertering van DNA, niet nodig voor het genereren van de constructie. Daarnaast kan een verwijderde of geconserveerde regio op het genoom flexibel worden gekozen volgens primer ontwerp.

In het huidige werk, werd verwijdering van de gehele codering regio van het gtfC -gen, dat glucosyltransferase in Streptococcus mutans codeert, uitgevoerd om aan te tonen van de snelle, gemakkelijke gene verstoring methode in een streptokokken soorten. Bovendien, een gtfB-verstoord stam was gegenereerd op dezelfde manier. De glucosyltransferases die zijn gecodeerd door zowel de gtfC als de gtfB bijdragen tot verwekkende tandheelkundige biofilm ontwikkeling^5,6. De biofilm-vormende capaciteiten van het wild-type stam (S. mutans WT), gtfC-verstoord stam (S. mutans ΔgtfC), en gtfB-verstoord stam (S. mutans ΔgtfB) werden geëvalueerd voor vergelijkende fenotypische analyses. Dit protocol de toepassing van een methode in twee stappen voor de verstoring van het gen voor een extra vissoort wordt uitgebreid en kan worden gewijzigd voor studies van de genfunctie in een breder scala van taxa.