Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige dreidimensionale in-vitro- Modell, wo Stromazellen Hornhautzellen und differenzierten neuronalen Zellen zusammen kultiviert werden, bei der Untersuchung und das Verständnis der Wechselwirkungen der beiden Zelltypen zu unterstützen.
Abstract
Gewebetechnik hat erhebliche Anerkennung aufgrund der hohen Nachfrage nach Ersatz der menschlichen Hornhaut mit schätzungsweise 10 Millionen Menschen weltweit leiden an Hornhaut Vision Verlust1gewonnen. Um der Nachfrage nach tragfähigen menschlichen Hornhaut, erhebliche Fortschritte im dreidimensionalen (3D) Gewebe erzielt Engineering2,3,4. Diese Hornhaut Modelle reichen von einfachen Monolage Systeme zu vielschichtigen Modelle, 3D Full-dicke Hornhaut äquivalente2.
Jedoch die Verwendung der 3D Tissue-Engineering Hornhaut im Zusammenhang mit der in-vitro- Krankheitsmodelle bis Datum fehlt Ähnlichkeit mit der vielschichtigen 3D Hornhautgewebe Struktur, Funktion und die Vernetzung der verschiedenen Zelltypen (z.B. Nerven, studierte Epithel, Stroma, Endothel)2,3. Darüber hinaus stieg die Nachfrage nach in Vitro Hornhaut Gewebemodelle in einem Versuch zur Verringerung von Tierversuchen für pharmazeutische Produkte. So, anspruchsvollere Modelle sind erforderlich, um Systeme zu menschlichen physiologischen Bedürfnissen besser zu entsprechen, und ist die Entwicklung eines Modells, die mehr für das Patientenkollektiv ist absolut notwendig. Angesichts der Tatsache, dass mehrere Zelltypen in der Hornhaut Krankheiten und Dystrophien, wie z. B. Keratokonus, diabetische Keratopathie und Fuchs betroffen sind, enthält dieses Modell ein 3D Kokultur Modell der primären menschlichen Hornhaut Fibroblasten (Treibgasen) von gesunden Spendern und Neuronen aus die SH-SY5Y-Zell-Linie. So können wir zum ersten Mal um die Wechselwirkungen zwischen den beiden Zelltypen innerhalb der menschlichen Hornhaut Gewebe zu untersuchen. Wir glauben, dass dieses Modell könnte potenziell sezieren die zugrunde liegenden Mechanismen zugeordnet die stromale Nerv Interaktionen von Erkrankungen der Hornhaut, die Nerven Schäden aufweisen. Dieses 3D Modell spiegelt die grundlegende anatomische und physiologische Natur des Hornhautgewebes in Vivo und in Zukunft als Instrument für Hornhaut Mängel zu untersuchen sowie die Wirksamkeit der verschiedenen Akteure vor Tierversuchen screening einsetzbar.
Introduction
Im menschlichen Körper ist die Hornhaut das am dichtesten innervierten Gewebe. Die Nerven sind verantwortlich für verschiedene Empfindungen wie Berührung, Schmerz, Temperatur und haben auch eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung, blinken Reflexe, tear, Produktion und Sekretion5,6,7. In der Hornhaut stromale Nerven Stämme ergeben sich aus der limbischen Plexus und geben Sie die periphere Hornhaut Stroma radial. Die stromale Nerv Organisation ist parallel zu der Kollagen-Lamellen und verzweigen sie weiter in kleinere Hefte wie sie in Richtung der oberflächlichen Stroma5,8 gehen. Die Nervenfasern weiter dringen die Epithelschicht und somit Innervation ist weit verbreitet über die Hornhaut-Epithel und Stroma. Daher hat die Innervation eine wesentliche Rolle bei der gesunden und kranken Zustand der Hornhaut. In diesem Protokoll zeigen wir die Weiterentwicklung eines neuartigen 3D in-vitro- Modells, das erste seiner Art, die in Vivo Stromazellen Nerv Interaktionen zu imitieren. Die SH-SY5Y-Zell-Linie wurde für diese Studie verwendet, da es eines der etabliertesten, gut charakterisierten Linien verwendet, um neuronale Wachstum zu untersuchen ist. Die SH-SY5Y-Zell-Linie wurde beschrieben, beide Substrat haftend (S-Typ) zu produzieren und neuroblastic (N-Typ) Zellen, die Transdifferenzierung9durchlaufen kann. Infolgedessen, obwohl diese Zelllinie aus einer Auswahl von drei aufeinanderfolgenden Subclone N-Typ-Zellen abgeleitet ist, enthält es auch eine kleine Anzahl von S-Typ-Zellen in der Lage, einer Differenzierung in Neuronen durch den Einsatz von Retinoic Säure und Gehirn abgeleitet neurotrophen Faktor9. Dies bietet ein Werkzeug, das zu einem besseren Verständnis der Hornhaut Komplikationen im Zusammenhang mit diabetischer Retinopathie (DM) und anderen okulären Erkrankungen führen kann. Aufgrund der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Erlangung und Kultivierung Neuronen von Patienten mit okulärer Erkrankungen bietet dieses 3D in-vitro- Modell erhebliche Auswirkungen auf die Untersuchung der neuronalen Wechselwirkungen und Signalisierung mit der Hornhaut Stroma.
Erkrankten Bedingungen betreffen häufig verschiedenen Geweben des Körpers zu einem sehr großen Maßstab, was zu einer kompromittierten Lebensqualität. Okuläre Dystrophien sind häufige Komplikationen, die oft im Zusammenhang mit systemischen Erkrankungen und zum Verlust der Sehschärfe oder sogar dauerhafte Sehverlust führen. Umfassende Studien sind oft unerlässlich für ein besseres Verständnis der Krankheitszustand sowie die Auswirkungen auf die basalen zellulärer Ebene. Um die Auswirkungen von Krankheiten zu untersuchen, wurden in Vivo und in Vitro -Modelle mit Hilfe des Tissue engineering-Anwendungen entwickelt. Hornhautgewebe Konstruktionsanwendungen haben großes Interesse in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft,10,11,12,13,14sammelte, aber es gibt nach wie vor erhebliche Einschränkungen während konkrete Anwendung, einschließlich der Hornhaut Transplantat Ablehnungen, Infektionen und Narbenbildung10,11,12,13,14. Es gibt mehrere Studien, die erfolgreich entwickelt und hergestellt von verschiedenen in-vitro- Modelle3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Die 3D in-vitro- Modelle sind die vielversprechendsten und von großem wissenschaftlichen Interesse. 3D Modelle sind dafür bekannt, die in Vivo zellulärer und physiologischer Ereignisse besser zu spiegeln, die sind kritische während Fibrose und Wunden heilenden15,27,28,29. Diese in-vitro- Modelle spielen eine wesentliche Rolle bei der Suche nach neuen Therapieansätzen für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen einschließlich der Hornhaut Komplikationen. Trotz der wichtigen Rolle der Innervation in Hornhaut Funktionen hat wenig Anstrengungen unternommen, Förderung der peripheren Nerven Verbreitung innerhalb der Hornhaut Tissue Engineering Konstrukten2,3. Allerdings imitieren die vorgeschlagenen 3D in-vitro- Zelle Konstrukte Zielgewebe um die gewünschte Gewebe-Funktionalität zu erreichen.
Während diabetische Keratopathie eine offensichtliche Anwendung für das Modell durch die neuronale Defekte hier beschrieben ist, gibt es mehrere andere Hornhauterkrankungen, die von einem menschlichen in-vitro- Modell einschließlich Keratokonus und Fuchs Dystrophien profitieren können. Unser 3D Modell ergibt sich aus dieser Perspektive und schlägt die Entwicklung einer in-vitro- Darstellung des Hornhautgewebe Drug-Delivery bewerten und neue ocular Arzneimittelsicherheit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung von verschiedenen Tiermodellen, die helfen, ein besseres Verständnis von Erkrankungen der Hornhaut entwickeln können, sowie Behandlungen zu entdecken. Ein erheblichen Wert für den Menschen aus diesen Studien wurde jedoch nicht bestätigt. Bisher sind verschiedene in-vitro- Modelle entwickelt und weithin wegen ihrer bemerkenswerten klinischen Bedeutung untersucht. Unser vorher festgelegten 3D in-vitro- Modell ist ein neuartiges System, das maßge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten unseren aufrichtigen Dank Dr. Ben Fowler für seine technische Hilfe bei der TEM-Experimente zu verlängern.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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