Ingénierie du tissu cornéen : Un In Vitro modèle des Interactions stroma-nerf de la cornée humaine
Summary
Ce protocole décrit un roman en trois dimensions in vitro model, où les cellules du stroma cornéens et différenciés de cellules neuronales sont élevées ensemble afin d’aider à l’examen et la compréhension des interactions entre les deux types cellulaires.
Abstract
Génie tissulaire a acquis une reconnaissance considérable en raison de la forte demande pour les remplacements de la cornée humaine avec environ 10 millions de personnes dans le monde souffrent de perte de vision cornéen1. Pour répondre à la demande de cornées humaines viables, des progrès significatifs dans le tissu en trois dimensions (3D) génie a2,3,4. Ces cornée modèles allant des systèmes monocouche simple aux modèles multicouches, menant à 3D pleine épaisseur cornéenne équivalents2.
Cependant, l’utilisation de la 3D corné tissulaire dans le contexte des modèles in vitro de maladies étudiées à date n’a pas de ressemblance avec la structure multicouche du tissu cornéen 3D, la fonction et la mise en réseau des différents types de cellules (c.-à-d., nerf, épithélium, stroma et l’endothélium)2,3. En outre, la demande pour les modèles de tissus in vitro cornée a augmenté dans le but de réduire l’expérimentation animale pour les produits pharmaceutiques. Ainsi, des modèles plus sophistiqués sont nécessaires afin de mieux correspondre aux besoins physiologiques humaines, les systèmes et le développement d’un modèle qui est plus pertinent à la population de patients est absolument nécessaire. Étant donné que plusieurs types de cellules de la cornée sont touchés par les maladies et les dystrophies musculaires, tels que le kératocône, kératopathie diabétique et Fuchs, ce modèle comprend un modèle 3D de co-culture de fibroblastes cornéens humaines primaires (CS) de donneurs sains et les neurones de la lignée de cellules SH-SY5Y. Cela nous permet pour la première fois étudier les interactions entre les deux types de cellules dans le tissu de la cornée humain. Nous croyons que ce modèle pourrait potentiellement disséquer les mécanismes sous-jacents liés à des interactions stroma-nerf de maladies de la cornée qui présentent des dommages de nerf. Ce modèle 3D reflète la nature fondamentale d’anatomique et physiologique du tissu cornéen in vivo et peut servir à l’avenir comme un outil pour étudier les défauts cornéens ainsi que l’efficacité des divers agents de dépistage avant l’expérimentation animale.
Introduction
Dans le corps humain, la cornée est un tissu plus densément innervé. Les nerfs sont responsables pour des sensations variées comme le toucher, la douleur, température et ont également un rôle essentiel dans la guérison des plaies, réflexes de cligner des yeux, déchirer la production et la sécrétion5,6,7. Dans la cornée, stromales troncs nerveux proviennent du plexus limbique et entrer dans le stroma cornéen périphérique radialement. L’organisation nerveuse stromales est parallèle aux lamelles de collagène et elles davantage créer une branche en petits fascicules comme ils aller de l’avant vers le stroma superficiel5,8. Les fibres nerveuses plus pénétrer la couche épithéliale et ainsi, innervation est largement étalée dans l’épithélium de la cornée et le stroma. Par conséquent, une innervation a un rôle essentiel dans l’état sain et malade de la cornée. Dans ce protocole, nous révélons la promotion d’un modèle nouveau 3D in vitro , qui est le premier du genre à simuler les interactions de stroma-nerf in vivo . La lignée SH-SY5Y a été utilisée pour cette étude, car il est une des lignes plus établis, bien caractérisés, utilisés pour étudier la croissance neuronale. La lignée SH-SY5Y a été décrite pour produire les deux adhérentes de substrat (type S) et les cellules neuroblastiques (type N) qui peut subir la transdifférenciation9. Ainsi, même si cette lignée cellulaire provient d’une sélection de triple sous-clone successives de cellules de type N, il contient également un petit nombre de cellules de type S capables de subir une différenciation dans les neurones grâce à l’utilisation de retinoic acid et encéphales Neurotrophic factor9. Ceci fournit un outil qui peut conduire à une meilleure compréhension des cornée complications associées de la rétinopathie diabétique (DM) et d’autres maladies oculaires. En raison des difficultés liées à l’obtention et la culture de neurones provenant de patients atteints de maladie oculaire, ce modèle 3D en vitro fournit des conséquences majeures en étudiant les interactions neuronales et la signalisation avec le stroma cornéen.
Conditions de malades affectent souvent divers tissus du corps à très grande échelle, menant à une qualité de vie compromise. Dystrophies oculaires sont des complications fréquentes, souvent associées aux maladies systémiques et conduire à la perte d’acuité visuelle ou une perte de vision voire permanente. Études approfondies sont souvent indispensables pour une meilleure compréhension de la maladie ainsi que les effets au niveau cellulaire basal. Afin d’étudier les effets de ces maladies, les différents modèles in vivo et in vitro ont été développés avec l’aide d’applications en génie tissulaire. Applications d’ingénierie du tissu cornéen ont suscité grand intérêt dans des domaines variés des sciences10,11,12,13,14, mais il y a des limitations majeures subsistent pendant application effective, y compris cornée greffe rejets, infections et cicatrices10,11,12,13,14. Il existe plusieurs études qui ont avec succès développé et mis en place diverses in vitro modèles3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Les modèles 3D in vitro sont les plus prometteurs et d’un grand intérêt scientifique. Les modèles 3D sont connus pour mieux refléter l’in vivo événements cellulaires et physiologiques qui sont essentiels au cours de la fibrose et enroulé de guérison15,27,28,29. Ces modèles in vitro jouent un rôle essentiel dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des différentes pathologies dont les complications cornéennes. Malgré le rôle essentiel de l’innervation en fonctions de la cornée, peu d’efforts accompli pour promouvoir la prolifération des nerfs périphériques au sein des constructions tissulaire cornéenne2,3. Toutefois, les constructions de cellule projet 3D en vitro imitent le tissu cible afin de réaliser la fonctionnalité désirée de tissu.
Kératopathie diabétique est une application évidente pour le modèle décrit ici les défauts neuronale, il y a plusieurs autres maladies de la cornée qui peuvent bénéficier d’un modèle humain in vitro y compris dystrophies kératocône et Fuchs. Notre modèle 3D se dégage de cette perspective et propose le développement d’une représentation in vitro de tissu cornéen pour évaluer l’administration de médicaments et de la sécurité des nouveaux médicaments oculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs études ont surtout portés sur le développement de divers modèles animaux peuvent aider à développer une meilleure compréhension des maladies de la cornée ainsi que découvrir des traitements. Toutefois, une valeur significative pour les humains de ces études n’a pas été vérifiée. A ce jour, différents modèles in vitro ont été mis au point et largement étudiés en raison de leur importance clinique remarquable. Notre modèle établie antérieurement 3D in vitro est un systè…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier sincèrement le Dr Ben Fowler pour son aide technique avec les expériences TEM.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
