Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Tutte le procedure di gestione degli animali e chirurgica sono state effettuate come approvato sotto la guida per la cura e uso di animali da laboratorio (Consiglio nazionale delle ricerche) e gli orientamenti della Indiana University School di medicina istituzionali cura degli animali e dell’uso Comitato. Illustrazione schematica del setup imaging 2-fotone è illustrato nella Figura 1. 1. preparare l’animale per l’Imaging Posizionare la garza sterile, tamponi di cotone e strumenti chirurgici sterilizzati nell’autoclave nell’area di chirurgia (tabella 1). Accendere un Micro Bead sterilizzatore per intersurgery sterilizzazione degli strumenti chirurgici. Anestetizzare il mouse (maschio o femmina, 1,5-2,5 mesi, 20 – 25 g) tramite l’iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238 mg/mL) (peso corporeo di 6 µ l/g). Attendere che la corretta profondità di anestesia è raggiunto quando l’animale cessa di rispondere ad uno stimolo di pizzico di punta e non ha nessun riflesso corneale. Durante l’intervento chirurgico, dare una dose di richiamo di 1/3 della dose originale dell’anestetico cocktail come necessario per mantenere lo stato originale di anestetico. Iniettare la buprenorfina per via sottocutanea (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) come agente analgesico prima della chirurgia. Applicare unguento protettivo per gli occhi dell’animale per evitare la formazione di cataratta e di essiccazione cornea. Posizionare un topo transgenico GCaMP6s su un rilievo di riscaldamento per prevenire l’ipotermia e coprirlo con un telo chirurgico sterile. Stabilizzare la testa dell’animale con un adattatore di Holding di testa per i topi. Radersi la testa sopra la maggior parte del cuoio capelluto con una lama di rasoio doppio taglio. Pulire l’area chirurgica con un tampone di alcool sterile preparazione seguito da soluzione povidone-iodio. 2. cronica cranica finestra preparazione Fare un taglio rettangolare del cuoio capelluto (2 x 3 mm) con un paio di forbici su un lato (a destra) del cranio. Spingere la pelle da parte con un batuffolo di cotone per creare un’area di esposizione di > 3 mm di diametro (Figura 3A). Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio raschiando delicatamente il cranio con una lama smussata microsurgical (bisturi lama n. 10; Figura 3). Delimitare la zona S1 delicatamente disegnando un cerchio (3 mm di diametro, centro coordinamento:-1,50 mm dal bregma e 2,5 mm dalla linea mediana) sul cranio usando uno studio dentistico trapano (Figura 2B). Eseguire la stessa procedura sul cranio sinistro (Figura 2B). Applicare un sottile strato di colla del cianoacrilato Super fino all’osso per fornire una base per applicazione di cemento dentale. Sotto un microscopio per dissezione, sottile giù una scanalatura circolare nel cranio intorno alla zona S1 utilizzando un microdrill ad alta velocità (Figura 3D). Lo scopo è quello di creare un bordo liscio per il posizionamento della finestra ottica su di esso. Applicare ripetutamente cerebrospinale artificiale (ACSF, temperatura ambiente) al cranio periodicamente durante il processo di diradamento per facilitare la foratura e dissipare il calore. Eseguire la foratura a intermittenza per evitare il surriscaldamento indotto da attrito. Succhiare via i detriti dell’osso con una linea del vuoto di casa o una pompa a vuoto. Dopo circa 2/3 di profondità dell’osso è forata, lentamente e con attenzione sottile osso restante 1/3 fino a quando un pezzo circolare del cranio (lembo osseo) è completamente esente da cranio circostante. Lentamente e con attenzione rimuovere il lembo osseo circolare con un paio di n. 5/45 forcipe ed esporre la dura madre (Figura 2; Figura 3E). La regione del cervello esposto. mantenere umido con ACSF (Figura 3E). Evitare danni ai vasi sanguigni pial, poiché l’emorragia sarà alterare il flusso sanguigno cerebrale, accelerare il gonfiamento del cervello e severamente degradare la qualità delle immagini. Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro (controlaterale) del cranio. Per il montaggio la finestra ottica, uso ottico adesivo colla e cura tra coprioggetto strati uno alla volta. Se necessario, riscaldare la finestra ottica (50 ° C per 12 h) in un’incubatrice per migliorare l’incollaggio. La finestra ottica contiene 2 porzioni: la parte superiore contiene un singolo vetro coperchio rotondo con un diametro di 5 mm e la parte inferiore contiene 1 – 3 vetri di coperchio rotondi con un diametro di 3 mm (Figura 2D). Memorizzare la finestra ottica in etanolo (70%, vol/vol) e sciacquarlo con soluzione salina sterile prima dell’uso. Prima dell’installazione di finestra ottica, controllare la finestra ottica per imperfezioni, tra cui una non corretta quantità di adesivo o imprecise allineate sotto uno stereoscopio. Installare la finestra ottica sopra la regione di craniotomia (Figura 2D). La parte superiore della finestra ottica poggia sul cranio e la parte inferiore della finestra ottica si inserisce all’interno dell’apertura craniotomized e poggia su dura in presenza di CSF (Figura 2D, E). Sigillare la parte superiore del bordo finestra ottica al cranio con la colla Super cianoacrilato (Figura 2F; Figura 3F). Quando il cianoacrilato Super colla si è asciugata, applicare il cemento dentale nero (Dentsply) per coprire il bordo di vetro. Applicare il cemento dentale per tutte le esposte del cranio e della ferita di margini di bloccare la luce (Figura 2-H; Figura 3B). Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro. Permettere all’animale di recuperare il termoforo e tornare l’animale alla sua gabbia a casa per il recupero sotto adeguata sorveglianza. Fornire cibo umido per facilitare la masticazione e idratazione. Per ridurre il dolore, amministrare buprenorfina s.c. (0.05 – 2,0 mg/kg) ogni postinjury di 8 – 12 h per 2 giorni. Consentire il mouse per recuperare per altri 7-10 giorni prima di formazione immagine. 3. due-fotone imaging Il giorno dell’esperimento, anestetizzare l’animale con ketamina e xilazina (dosi e mantenimento dell’anestesia come descritto sopra). Pulire la finestra cranica con etanolo al 75% (vol/vol). Posizionare il mouse sotto un imaging set-up che consiste di un microscopio di P 2 e l’adattatore di testa Holding, che riposa su un rilievo di riscaldamento con la sua testa immobilizzata attraverso le sbarre di orecchio attaccati a un titolare di testa del mouse. Un lato della finestra ottica dell’immagine alla volta. Per minimizzare le aberrazioni ottiche, assicurarsi che la finestra ottica e cranio giusto sono orientati perpendicolarmente all’asse ottico del microscopio. Prendere un’immagine iniziale della finestra cranica con illuminazione in campo chiaro con un ingrandimento 4x come una mappa di riferimento per la registrazione con angiografie di maggiore ingrandimento 2P (Figura 4A1). Ingrandire l’area di interesse utilizzando ingrandimento 10x (Figura 4A2). Selezionare un’area di interesse in zona S1 in strati corticali I o II (fino a 150 µm sotto la superficie pial). Se si desidera maggiore ingrandimento, utilizzare un obiettivo X 20. Ricerca di un campo di vista con più neuroni. Acquisire immagini utilizzando un microscopio di 2P (Figura 4B). Determinare il tempo di esposizione e livello luce di eccitazione (≈910 nm) basato sulla profondità e livello di espressione di GCaMP6s, con i segnali più deboli che richiedono tempi di esposizione più lunghi e concordemente meno risoluzione temporale. Generalmente utilizziamo ~ 4 µs per tempi di esposizione di pixel. Acquisire immagini a frame rate di 3 – 5 Hz con una risoluzione di 512 × 512 pixel. Iniziare a registrare la serie temporale. Memorizzare le coordinate di ogni regione di interesse (ROI) relativo il pattern vascolare o ai punti fiduciali in immagini di ingrandimento basso. Immagine il ROI stesso nel tempo. Eseguire la stessa procedura per osservare la dinamica del calcio della zona S1 sull’emisfero sinistro. Calcolare le modifiche in fluorescenza da ogni ROI. Acquisire le immagini singolarmente o in un filmato time-lapse (Figura 41-C3, D, E). Studio corticale sangue flusso dynamics in vivo da imaging coloranti fluorescenti destrano iniettati nella vena della coda dei roditori con microscopia di 2P. Utilizzare vasculatures come punti di riferimento per riconoscere e immagine la stessa ROI in sessioni di formazione immagine per lunghi periodi. 4. elaborazione dei dati Utilizzare ImageJ e origine per analisi di immagine. Importare sequenze di immagini con ImageJ (Figura 5A-B). Per immagini singole (o t-serie film), selezionare un ROI all’interno di un neurone imaged e 2 separati nelle vicinanze di regioni per la misura di sfondo (Figura 5). Acquisire totale intensità con un manager di ROI (Figura 5C).Nota: La figura 6 Mostra immagini rappresentative del calcio. Transitori di calcio (verde) e dei vasi sanguigni (rosso) mostrano in diversi momenti in secondi (Figura 6A-D) in un mouse alla 7D dopo l’installazione iniziale della finestra. Viene mostrata anche la z-proiezione di un periodo di registrazione di 3 min per canali rosso e verde (Figura 6E) o canale verde (Figura 6F). Una z-proiezione consente di visualizzare un’immagine compressa di tutte le immagini del film da cui un contorno grezzo e cerchio (che comprende il neurone oggetto di interesse in tutti i frame) è selezionato manualmente così come la selezione di 2 indipendente nelle vicinanze di regioni di sfondo ( Figura 6). Da ogni ROI, calcolare lo sfondo di fluorescenza media FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e le modifiche di fluorescenza del soma (F) espressa come ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB. Eseguire l’analisi di picco passo dopo passo utilizzando funzioni di ImageJ tra cui correzione della linea di base, picco individuazione/determinazione, integrazione di picco, picco raccordo o rubriche picco funzioni di analisi.