G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği
Summary
Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.
Abstract
DNA ikileşmesi S aşaması hücre döngüsünün ilerlemesini takip etmek çok sayıda teknikleri geliştirilmiştir. Bu tekniklerin çoğu aydınlatma konumunun ve inisiyasyon tamamlanması yerine genom çoğaltma zamanlaması doğru yönetti. Ancak, bu bölgelerde yüksek seviyede kromozom kırılma ve mutasyon muzdarip çünkü son çoğaltma, tamamlamak üzere olan bölgeler genom kopyası anlıyoruz ve hastalık ve yaşlanma ile ilişkili olmuştur önemlidir. Burada nasıl yerine bölgelere genom kopyası son tam çoğaltma için tanımlamak için çoğaltma başlatma izlemek için kullanılan bir teknik genişletilmiş var açıklar. Bu yaklaşım Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralamanın kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu rapor bu tekniği uygulamaya Maya üzerinde duruluyor olsa da, yaklaşım, bir Akış Sitometresi DNA içeriği göre sıralanan hücreler ile kullanılabilir.
Introduction
Ökaryotik genom çoğaltma çoğaltma, hangi çoğaltma dışında çatal (Fragkos ve ark.içinde 20151gözden) her iki yönde devam kökenleri denilen birden çok ayrı site başlatılır. Kökenleri değişir hem kendi zamanlama ve ateş verimliliğini ve çoğaltma kaynağı etkinliğini izlemek ve bu değişim nedenleri aydınlatmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Etkinlik bireysel kökenli tek iplikçikli DNA2, hangi formların etkin kökenleri, çevresinde düzeylerinden anlaşılmaktadır olabilir veya 2D Jel Elektroforez belirli çoğaltma ara ürün3izlemek için kullanarak, her ikisi ile tespit edilebilir radyoaktif sondalar. Kökeni eski belirli bilinen sıralarını sınırlı olduğu için bu tekniklerin her ikisi de daha kolay S. cerevisiae memeli hücrelerinde uygulanır. Microarrays gelişiyle, genel olarak ateş kökenli değerlendirmek mümkün oldu. Bu ilk DNA ile ağır izotoplar etiketleme, orta içeren hafif izotopların bir G1 blok hücrelerden serbest ve ağır-hafif hibrid DNA genom4arasında oluşumu izleme tarafından yapıldı. Yüksek işlem hacmi sıralama giriş benzer genom geniş izleme kökenli faaliyet pahalı izotopik etiketleme zorunluluğu olmadan izin. Hücreleri DNA içeriği göre Akış Sitometresi ve derin sıralama için tabi DNA’ları sıralanmış. Sıra kapsama 1 x 2 x S faz boyunca devam eder çünkü göreli çoğaltma zamanlaması S aşamasında G1 veya G25,6, olanlar için hücre okuma derinliği karşılaştırarak tespit edilebilir. Bu teknikler, özellikle Maya için uygulanan kaynak zamanlaması ve verimlilik nasıl DNA dizisi, Kromatin yapısı ve DNA çoğaltma proteinler düzenleyen daha derin bir anlayış için yol açtı.
Sadık iletim hücresel proliferasyonu sırasında genetik bilgi DNA ikileşmesi, kökeni yer alan yalnızca başarılı inisiyasyon, aynı zamanda başarılı bir şekilde tamamlanması, çoğaltma, çoğaltma çatal buluştuğu oluşur gerektirir. Çoğaltma başlatma gibi genom arasında bile geç Hücre döngüsünde çoğaltılmamış kalan belirli bölgelerde tamamlama çoğaltma zamanlaması göre değişir. Gibi bölgelerden özellikle etkin çoğaltma kökeni uzak olabilir veya dizileri veya DNA polimerazlar engel Kromatin yapıları içerebilir. Geç bölgeleri çoğaltma kendilerini kromozom kırılma ve yüksek mutasyon oranları ile ilişkili olan ve kanser ve yaşlanma7,8,9karıştığı kırılgan siteler olarak bildirilebilir. Ancak, uygun bakım DNA ikileşmesi genom istikrar tamamlanması önemini rağmen bizim anlayış nerede ve nasıl bu gerçekleşir kadar bu çoğaltma başlatma gecikmeli. Ve bireysel genler olan geç çoğaltma hastalığı ile ilişkili olduğu süre ile örneğin, qPCR10, yerleri elucidating ve nedenleri geç çoğaltma eksik yatan, yönetmen küresel çalışmalar incelenmiştir. Burada “Biz Akış Sitometresi ile yüksek işlem hacmi sıralama genom çoğaltmasında tamamlanması ışık içinde birleştirmek G2 seq” olarak11Maya anlamlara bir tekniğini tanımlamak. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı akışı DNA içeriği göre sıralanmış olabilir herhangi bir hücre için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik sağlamdır ve nispeten düz ön, özellikle dikkat için aşağıdaki ayrılmış ise:
(1) biz yoksa kültürleri istenen yoğunluk sadece 4 h aşı sonra ulaşmış sonra hasat farklılıklar hücre döngüsü dağıtımları içinde tezahür beri onlar log fazı, ulaşmadan kültürler en az 12 h için büyümek öneririz. Varsayımımız nispeten istikrarlı bir denge ulaştı bir hücre döngüsü dağıtım daha iyi doymuş bir kültür son zamanlarda taze ortamına Transfer ed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe A.B. NIH GM117446 tarafından desteklenmiştir
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
