G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Eukaryotische genoom replicatie wordt gestart op meerdere afzonderlijke locaties, oorsprong van replicatie, van welke replicatie vorken gaan in beide richtingen (herzien in Fragkos et al., 2015¹) genoemd. Oorsprong variëren in zowel hun timing en de efficiëntie van vuren, en verscheidene technieken zijn ontwikkeld om te controleren van de replicatie oorsprong activiteit en het ophelderen van de oorzaken van deze variatie. De activiteit van individuele oorsprong kan worden afgeleid uit de niveaus van single-stranded DNA², welke vormen rond de oorsprong van het actief, of met behulp van 2D gelelektroforese volgen specifieke replicatie tussenproducten³, die beide kunnen worden opgespoord met radioactieve sondes. Beide technieken zijn gemakkelijker toegepast in S. cerevisiae dan bij zoogdiercellen omdat oorsprong beperkt tot specifieke bekende opeenvolgingen in de voormalige zijn. Met de komst van microarrays werd het mogelijk om te beoordelen van oorsprong afvuren wereldwijd. Eerst gebeurde dit door het labelen van DNA met zware isotopen, cellen van een blok van de G1 vrijgeven in medium met lichte isotopen en vervolgens toezicht op de vorming van zware-licht hybride DNA in het genoom⁴. De invoering van hoge-doorvoer sequencing toegestaan soortgelijke genoom-brede monitoring van oorsprong activiteit zonder de eis van dure isotopische labeling. Cellen werden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA inhoud en hun DNA onderworpen aan diepe sequencing. Omdat de sequentie dekking opbrengst van 1 x tot 2 x in de loop van de S-fase, kan replicatie van de relatieve timing worden beoordeeld door vergelijking van Lees diepten van cellen in de S-fase aan die van de G1 of G2^5,6. Deze technieken, met name toegepast op gist, geleid tot een dieper begrip van hoe opeenvolging van DNA, chromatine structuur en DNA replicatie eiwitten oorsprong timing en efficiëntie reguleren.

Trouwe transmissie van genetische informatie tijdens cellulaire proliferatie vereist niet alleen succesvol inleiding van DNA-replicatie, die plaatsvindt op de oorsprong, maar ook de succesvolle voltooiing van de replicatie, die optreedt waar de replicatie vorken ontmoeten. Als inleiding van replicatie verschilt het tijdstip van voltooiing van de replicatie het genoom met bepaalde regio’s resterende niet-gerepliceerde zelfs laat in de celcyclus. Dergelijke regio’s mogelijk met name ver van actieve replicatie oorsprong of sequenties of chromatine structuren die de polymerase van DNA belemmeren kunnen bevatten. Laat het repliceren van regio’s kan manifesteren zich als kwetsbare sites, die worden geassocieerd met een chromosomale breuk en een hogere mutatie, en zijn betrokken bij kanker en veroudering^7,8,9. Ondanks het belang van goede voltooiing van DNA-replicatie voor handhaving van de stabiliteit van het genoom, heeft ons begrip van waar en hoe dit gebeurt echter bleef ver achter dat van replicatie inleiding. En terwijl afzonderlijke genen waarvan laat replicatie geassocieerd met de ziekte is zijn bestudeerd met, bijvoorbeeld, qPCR¹⁰, global studies gericht op het ophelderen van de locaties en de onderliggende oorzaken van een te late replicatie hebben ontbroken. Hier beschrijven we een techniek die we verwijzen naar het als “G2 seq” waarin we stroom cytometry combineren met hoge doorvoersnelheid sequencing licht te werpen op de voltooiing van de replicatie van het genoom in gist¹¹. Met kleine wijzigingen, kan dit protocol worden aangepast aan alle cellen die stroom-gesorteerd op basis van DNA-inhoud worden kunnen.