Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation
Summary
Fehlanpassungen in human Leukocyte Antigen (HLA) Sequenzen zwischen Organspender und Empfänger-Paare sind die Hauptursache der Antikörper-vermittelten Ablehnung im Organ-Transplantation. Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von benutzerdefinierten Antigen-Arrays, die auf einzelnen Spendern HLA Sequenzen, Anti-Spender HLA Alloantibodies in Organempfängern Sonde basieren.
Abstract
Im Organ-Transplantation verlassen die Funktion und Langlebigkeit des Transplantats kritisch auf den Erfolg des Controllings immunologische Ablehnung Reaktivität gegen humanen Leukozyten-Antigene (HLA). Histocompatibility Leitlinien basieren auf Labortests der Anti-HLA-Immunität, die entweder als bereits bestehende präsentiert oder de Novo generierte HLA-Antikörper, die eine große Transplantation Barriere darstellen. Aktuelle Tests basieren auf einer Single-Antigen Perlen (SAB) Plattform mit einem festen Satz von ~ 100 vorausgewählten rekombinante HLA-Antigene Transplantation Sera zu untersuchen. Beim Menschen gibt es jedoch eine weit größere Vielfalt an HLA-Typen, mit keine zwei Personen als eineiige Zwillinge, die die gleiche Kombination von HLA-Sequenzen teilen können. Während fortschrittliche Technologien zur HLA-Typisierung und direkte Sequenzierung genau Fehlanpassungen in DNA-Sequenz zwischen des Spenders erfassen können und des Empfängers HLA, SAB-Assay, wegen seiner begrenzten Vielfalt in Sequenz Darstellung nicht in der Lage ist, genau zu erkennen Alloantibodies speziell gegen die Spender-HLA-Fehlanpassungen. Wir wollten eine ergänzende Methode durch eine andere Technik zu erkennen und charakterisieren Anti-Spender-HLA-Antikörper auf einer persönlichen Basis zu entwickeln. Die Screening-Tool ist eine benutzerdefinierte Peptid-Array der Spender HLA-abgeleitete Sequenzen zum sondieren nach der Transplantation Sera von der Orgel-Empfänger zur Bewertung des Risikos für die Antikörper-vermittelten Ablehnung. Auf einem einzelnen Array für ein Geber-Nehmer-paar sind bis zu 600 einzigartige Peptide auf Basis des Spenders HLA Proteinsequenzen, jedes Peptid tragen mindestens eine nicht übereinstimmende Rückstand in einer 15-amino Acid Sequenz getroffen. In unseren Pilotversuchen Antigen Muster für vor und nach der Transplantation Sera auf diese Arrays vergleichen konnten wir Anti-HLA-Signale mit der Auflösung zu erkennen, die auch uns erlaubt, die immun Epitope beteiligten genau zu bestimmen. Diese personalisierte Antigen Arrays ermöglichen hochauflösende Detektion von Spender-spezifischen HLA Epitope in Organtransplantation.
Introduction
Orgel-Ersatz-Therapie, die routinemäßig in der ganzen Welt durchgeführt wird, hat Millionen von Menschenleben gerettet. Solide Organtransplantationen tritt in etwa 100 Patienten pro million Einwohner in den USA jährlich, während eine größere Anzahl noch auf Wartelisten Spenderorgane durch eine starke Verknappung des Angebots (nach Angaben der Orgel zu erhalten Beschaffung und Transplantation Netzwerk – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation ist stark reguliert, um Orgel Abfall zu reduzieren und Leben zu retten, aber die wissenschaftlichen Werkzeuge verwendet, um diese Vorschriften zu informieren sind in ihrer Wirksamkeit begrenzt. Zum Beispiel, die wissenschaftliche Gemeinschaft voll anerkennt die höchst polymorphen Zustände der HLA-Moleküle und genaue genetische Untersuchungen der DNA mit Hilfe von hochauflösenden Typisierung und Sequenz-basierte Typisierung (SBT) entstanden in den letzten Jahren1, 2., Alloantibody Testmethoden wurden noch nicht in der Lage, die enorme Vielfalt an individuellen HLA-Sequenzen als Antigen Sonden zu produzieren. Der Standardtest nutzt heutzutage eine unveränderliche Panel ~ 100 allelische Antigene, die gängige Varianten der HLA bestehen, A, B, C, DQ, DP und DR Sequenzen in menschlichen Populationen3,4,5,6. Häufig die tatsächliche Spender HLA Sequenzen gehören nicht in Testpanel zwingen Transplantation Ärzte und Chirurgen Spender-spezifische Reaktivität basierend auf gemeinsamen Ähnlichkeiten zwischen tatsächlichen Sequenzen und entsprechenden “Standards” des Spenders ableiten der Test set7,8. Infolgedessen ist es manchmal schwierig, eine zuverlässige Schätzung der Ablehnung Risiko basierend auf Antikörper Test Ergebnisse9,10,11,12zu machen. Daher sind neue persönlich anpassbare Tests für Alloantibodies dringend benötigte13,14.
Die HLA-Gene kodieren die großen Histocompatibility komplexesten (MHC) Rezeptoren, die eine Schlüsselfunktion in Immunantworten6haben. HLA-Gene sind dafür bekannt, die meisten polymorphen Gene des menschlichen Genoms6sein. Aufgrund der rasanten Fortschritte in der DNA-Sequenzierung Strategien für die HLA-Gene, neue allelische Varianten (oder einfach als Allele bezeichnet) werden um eine explosive Geschwindigkeit15,16entdeckt. Bis März 2017 16.755 validierten Allele hatte hinterlegt worden der IMGT/HLA-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), von denen 12.351 waren Klasse ich und 4.404 waren der Klasse II. Gruppe. Im krassen Gegensatz dazu sind nur ein wenig mehr als 100 verschiedene Allele im Test standard Einzel-Antigen Perlen (SAB) vertreten, die routinemäßig zur Alloantibodies bei Organtransplantationen eingesetzt. Die EAV-Methode baut auf einem Luminex-Plattform mit Durchflusszytometrie. Da der Test einen unveränderlichen Satz von Antigenen, abgesehen von geringfügigen Charge zu Charge Variabilitäten in der Produktion nutzt kann Antiserum Test robust über Einzelpersonen und Laboratorien5standardisiert werden. Dieser Test ist jedoch nicht in der Lage zu erfassen alle Alloantibodies entwickelt speziell gegen die Spender-Allele, insbesondere dann, wenn der Spender-Sequenzen Fehlen von der EAV eingestellt. Auftragsproduktion von Geber Antigene basierend auf wahren Sequenzen sind, zwar wünschenswert bleiben es technische Herausforderungen bei der Straffung der notwendigen Produktions- und Prüfverfahren.
Eine alternative Methode in einer Machbarkeitsstudie der Nierentransplantation Themen17vor kurzem beschrie- Die Methode verwendet Peptid-Antigene in einem Array-Format zum sondieren vor und nach der Transplantation Sera der einzelnen Subjekte. Jedes Array wurde mit Hilfe der SPOT Synthese Methode18,19,20,21,22,23 , das Peptid-Antigene, jeder 15 produziert Aminosäuren in der Länge, ausschließlich anhand der jeweiligen Organspender HLA-Allele a, B, C, DQA1, DQB1 und DRB1. SPOT-Synthese wird auf einer Zellulose-Membran mit standard Fmoc-Chemie22 betrieben und produzieren Hunderte von benutzerdefinierten Peptide parallel mit einem vollautomatischen Roboteranlage19,21. Das Membran-Array kann mehrere Wahlrunden Abisolier- und reprobing Zyklen standhalten. In unserer retrospektive Studie17werden Änderungen im Antigen-Muster mit gespeicherten Transplantation Antiseren gesammelt in einer Zeitreihe (d. h. vor und nach der Transplantation) erkannt. Hier beschreiben wir die technische Protokoll für den Workflow einschließlich Array Design, Fertigung, Antiserum sondieren und Ergebnis-Analyse. Die Methode dient zur Erkennung von Alloantibodies gegen bestimmte lineare Epitope auf Transplantation Geber HLA-Moleküle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Design des hier beschriebenen Ort Arrays ist für experimentelle Studie über Alloantibody Spezifität in der Transplantationsmedizin gegen ein Organspender HLA-Antigene. Im Gegensatz zu den bestehenden SAB-Assay weitgehend verwendet in Klinik hat die Antigen-Array-Methode einen großen Vorteil im flexiblen Design, das die wahre HLA-Sequenzen des einzelnen Spenders aufnehmen können. Die neue Plattform nutzt die Potenziale der rasant fortschreitenden Technologie DNA-Sequenzierung, der bald in der Lage, genaue HLA All…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei DRS. Shawn Li und Xing Li der Western University in Kanada für ihre freundliche Unterstützung mit SPOT array Produktion. Wir sind dankbar für die Mitarbeiter der Histocompatibility Kern und an der umfassenden Transplant Center der Northwestern University für die Probe Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Hilfskräfte der Northwestern Memorial Hospital und durch eine Fakultät Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Northwestern University, j.j. unterstützt.
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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