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신경과학

Transection parziale del nervo ottico in ratti: un modello stabilito con un nuovo approccio operativo per valutare la degenerazione secondaria delle cellule ganglionari retiniche

Published: October 15, 2017
doi:
10.3791/56272
, , , , , , ,
1Aier School of Ophthalmology,Central South University, Changsha, China, 2Institute of Immunology,Tsinghua University School of Medicine, Beijing, China, 3Beijing Tongren Eye Center,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China, 4Beijing Institute of Ophthalmology,Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China

Summary

Degenerazione secondaria delle cellule retiniche del ganglio (RGCs) si verifica comunemente nel glaucoma. Questo studio descrive un innovativo approccio operativo per il transection parziale del nervo ottico. L’utilizzo di questo approccio operativo salvaspazio amplia la gamma di applicazione del modello e permette l’esplorazione dei meccanismi di danno secondario in RGCs in modo nuovo.

Abstract

Gli studi precedenti hanno dimostrato che la degenerazione secondaria delle cellule retiniche del ganglio (RGCs) si verifica comunemente nel glaucoma. Il transection parziale del nervo ottico è considerato un modello utile e riproducibile. Rispetto ad altri modelli di lesione del nervo ottico utilizzati comunemente per valutare la degenerazione secondaria, ad esempio il transection completo del nervo ottico e modelli di schiacciamento del nervo ottico, il modello di transection parziale del nervo ottico è superiore come si distingue in primario da degenerazione secondaria in situ. Pertanto, serve come un ottimo strumento per la valutazione di degenerazione secondaria. Questo studio descrive un nuovo approccio operativo del transection parziale del nervo ottico accedendo direttamente all’area del nervo ottico retrobulbar tramite la parete orbitale laterale del bulbo oculare. Inoltre, vi presentiamo uno strumento chirurgico di nuova concezione, a basso costo per assistere con il transection. Come dimostrato dai risultati rappresentativi nel distinguere il confine delle aree di lesioni primarie e secondarie, il nuovo approccio e strumento assicura alta efficienza e la stabilità del modello fornendo uno spazio adeguato per l’intervento chirurgico. Questo a sua volta rende facile separare il fodero meningeo e oftalmici sanguigni dal nervo ottico prima transection. Un ulteriore vantaggio è che questo approccio operativo salvaspazio migliora la capacità degli investigatori per amministrare farmaci, vettori o traccianti RGC selettivi per il moncone del nervo ottico parzialmente transected, consentendo l’esplorazione dei meccanismi dietro lesione secondaria a RGCs, in un modo nuovo.

Introduction

Degenerazione secondaria si verifica comunemente nel sistema nervoso centrale (SNC) dopo lesioni traumatiche e seguenti malattie neurodegenerative acute e croniche. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 la morte di neuroni e cellule gliali come conseguenza precoce degli eventi patologici primari è chiamata degenerazione primaria, mentre la degenerazione secondaria si riferisce alla morte di neuroni e cellule gliali, che non sono interessate o solo parzialmente di primaria danni. Degenerazione secondaria di RGCs è anche creduta di verificarsi nel glaucoma. 6 Yoles et al. 7 ha confermato che la lesione secondaria di RGCs si verifica nel modello di lesione del nervo ottico. Hanno mostrato che i neuroni cui assoni non sono stati feriti dopo un danno acuto alla fine degenererà dovuto degenerativa ambiente prodotto dal pregiudizio che circonda questi assoni. Questa degenerazione secondaria colpisce i neuroni in modo progressivo, legati alla gravità del danno inflitto. Finora, i meccanismi alla base di danni RGC nel glaucoma rimangono poco chiari, in particolare quelle relative alla ferita secondaria, che si traduce in insufficiente trattamento clinico. 8 , 9 , 10 perciò, è necessario esplorare i meccanismi di degenerazione secondaria del RGCs durante lo sviluppo del glaucoma. 11 creazione di modelli animali di lesioni secondarie che possono valutare quantitativamente le dimensioni, la distribuzione e il meccanismo di degenerazione secondaria di RGCs attira l’attenzione crescente dagli scienziati che studiano la lesione secondaria di RGCs.

Per chiarire questo problema, un modello PONT del ratto è stato fondato da Levkovitch-Verbin et al. 12 per valutare la lesione assonale indotta degenerazione e morte di RGCs. Si ritiene che questo modello costituiscono un ottimo strumento per esplorare i meccanismi di degenerazione secondaria e identificare i potenziali agenti neuroprotective. Lo strumento utilizzato per generare questo modello di lesione secondaria è un coltello di diamante con una scala a transetto quantitativamente mediante l’impostazione della profondità di abscissione attraverso la manopola, al fine di completare un quantitativo transection del nervo ottico. Il percorso chirurgico si avvicina dal conjunctiva bulbo oculare verso l’alto o temporale. Durante il processo operativo, retina e nervi ottici potrebbero risentirne dalla forza del forcipe, che a sua volta può causare la ferita primaria. Ancora più importante, a causa dello spazio limitato del nervo ottico esposto, è difficile separare il fodero meningeo prima incisione. Di conseguenza, è possibile danneggiare i vasi oftalmici durante il transection parziale del nervo ottico, che provoca ischemia retinica e il fallimento del modello. Inoltre, il coltello di diamante è costoso, e ogni utilizzo diminuisce la nitidezza di punta. Questo potrebbe a sua volta influenzare la profondità e l’effetto di modellazione.

Il modello di degenerazione secondaria di RGCs descritti in questo studio è stato ottenuto attraverso un nuovo approccio operativo da parete orbitale laterale del bulbo oculare. Questo nuovo approccio operativo accede direttamente al nervo ottico retrobulbar circondato dal cono muscolo orbitale, evitando la ferita primaria per il bulbo oculare e del nervo ottico quando tirando verso il basso o verso il lato nasale laterale del bulbo oculare. Anche questo aumenta lo spazio di intervento chirurgico durante la definizione del modello e consente di isolare fodero meningeo prima parzialmente transecting il nervo ottico. È importante notare che l’eventuale coinvolgimento e lesioni dei vasi oftalmici può portare al fallimento del modello. Inoltre, il modello consente una valutazione successiva del cellule trasfettate, farmaci e reagenti sul moncone del nervo ottico parzialmente transected. Lo strumento chirurgico self-progettato è economico e può essere utilizzata più volte, riducendo così il costo di modellazione. Il modello di lesione secondaria di RGCs stabilito da questo metodo è stato indicato per avere stabilità e buona riproducibilità.

Protocol

procedure che coinvolge soggetti animali sono state approvate dall’animale istituzionale con cautela e Comitato (IACUC) dell’Università di medicina di capitale. Tutte le soluzioni e gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati prima della chirurgia per limitare l’infezione microbica. Nota: il protocollo chirurgico incluso cinque parti, vale a dire l’anestesia, approccio chirurgico, valutazione del nervo ottico, chiusura e ripristino. Per assistere con il transection parziale quantitativo del nervo ottico, è stato progettato uno strumento chirurgico di nuovo, a basso costo. Tutte le procedure sono state effettuate seguendo regole etiche e la tecnica chirurgica. 1. tecnica chirurgica effettuano esperimenti usando la tecnica asettica; protocolli per uso animale dovrebbero essere istituzione specifica. Sterilizzare strumenti e materiali (soluzioni, le sostanze da saggiare, traccianti, aghi, ecc.) vengono a contatto con tessuti viventi al fine di prevenire l’infezione e gli impatti negativi sul benessere degli animali nonché i potenziali impatti negativi sullo studio . 2. Anestesia ratti Anesthetize SD utilizzando un sistema di vaporizzatore veterinario isoflurano. Utilizzare ossigeno medicale ad un tasso di 1 L/min per vaporizzare il gas isoflurano. Posizionare l’animale nella casella allegati anestesia ed eseguire isoflurano ad una concentrazione di 4,5% fino a respirazione lenta e sedazione animali. Passare il flusso di gas per l’allegato di maschera antigas e metti l’animale sul tavolo operatorio. Abbassare la concentrazione di isoflurane all’anestesia 2% e il monitor. Gli animali più grandi (> 300 g) possono richiedere una maggiore concentrazione di isoflurane. Monitorare l’anestesia durante l’intervento chirurgico, con isoflurano dosaggio adeguato di conseguenza. Costantemente valutare la profondità e il tasso di respirazione ed eseguire punta pizzico valutazione ogni 5 min, per garantire l’assenza di dolore profondo. Una volta completata l’operazione, spegnere l’isoflurano e permettere all’animale di ossigeno respiro per alcuni minuti prima della rimozione della tabella di funzionamento. Mantenere la temperatura corporea che copre l’animale con una coperta chirurgica e/o utilizzando una coperta di riscaldamento regolabile durante la chirurgia. 3. Auto-progettato strumento assistente chirurgico (SSAI) uso un SSAI realizzato in acciaio inox e principalmente comprende un palo portatile (lunghezza, 100 mm; diametro, 9 mm) e una testa scanalata ( Figura 1). La superficie scanalata della testa scanalata è semi-circolare, con profondità verticale, larghezza e lunghezza di 200 µm, 500 µm e 1.000 µm, rispettivamente. Tra le due parti, c’è una sezione del giunto con una lunghezza di 50 mm. La testa scanalata ' s edge è larga 300 µm. Nota: La superficie scanalata consente la stabilizzazione del nervo ottico ventrale per il transection. Il dorsale del nervo ottico è esposto all’esterno della scanalatura quando depone il lato ventrale del nervo ottico all’interno di esso; nel frattempo, il dorsale del nervo ottico esposto al bordo scanalato può essere attraversato quando viene eseguito il taglio verticale. Nervo ottico ventrale in cui all’interno della superficie scanalata è protetto dalla testa scanalata ' bordo di s. Raggiungere la lesione primaria in RGCs corrispondente al nervo ottico quantitativamente transected assoni (lato dorsale), mentre il secondario pregiudizio verrebbe eseguita nel RGCs corrispondente al nervo ottico untransected assoni (lato ventrale) senza danni diretti. 4. Approccio chirurgico posto il lato destro del ratto sul tavolo chirurgico con testa rivolta verso il chirurgo. Regolare la giusta orbita al centro del campo di vista chirurgico. Quindi, pulire l’area di incisione più volte lungo il canthus laterale all’orifizio esterno acustico della pelle orbitale di destra, l’applicazione di clorexidina 0,5% in etanolo al 75%. Rimuovere la pelliccia tra canthus laterale all’orifizio esterno acustico utilizzando forbici iris. Fare un’incisione della pelle utilizzando forbici iris lungo canthus laterale all’orifizio esterno acustico con una lunghezza di 0,5-1 cm. Poi, un pizzico della gronda e tirare verso l’alto per creare un cuneo triangolare con forcipe dentato 0,12 mm. Inserire la lama inferiore di Allerød primavera forbici l’area d’incisione e taglio aperto la fascia nella stessa direzione di taglio. Taglio la fascia con Allerød primavera forbici ed esporre la vena orbitale. Uso forcipe dentato sharp per bloccare i lati della vena orbitale e smussato aprire entrambi i lati dell’incisione. Posizionare la vena orbitale in direzione della superficie del muscolo orbitale, che è posizionata per facilitare operazioni di follow-up chirurgica e per evitare l’intervento chirurgico correlati a sanguinamento della vena orbitale. Utilizzare forbici iris per tagliare il diritto canto laterale lungo la linea di incisione per esporre completamente il campo visivo per dissezione smussa dei muscoli orbitali durante il follow up. Continua per bloccare la cartella del muscolo orbitale sottofasciale e smussato separare verticalmente in direzione dell’incisione della pelle e la fascia. Separati lungo i lati gradualmente a raggiungere la profondità orbitale, fino alla comparsa del tessuto adiposo orbitale. Dopo l’esposizione del tessuto adiposo orbitale, cambiare la direzione della testa del ratto da rivolti verso il chirurgo verticalmente al lato destro del chirurgo. Nel frattempo, mantenere la zona costantemente umido utilizzando chirurgica o tamponi di cotone contenenti PBS sterile. Questa procedura assicura una visione chiara del campo chirurgico, mantenendo i tessuti, umida e morbida. 5. L’accesso al nervo ottico tagliare tessuti adiposi orbitali che copre il cono del muscolo orbitale intorno al nervo ottico nella cavità orbitale. Questo assicura una migliore esposizione dell’approccio chirurgico appropriato. Tenere la resezione del tessuto grasso limitato per evitare sostenuta sanguinamento. Tagliare il tessuto grasso, esponendo il rectus laterale. Morsetto del rectus laterale verso l’esterno e poi tagliare con forbici di primavera di Allerød. Se il tessuto grasso rimane sotto il rectus laterale, tirare sul grasso che ricopre il nervo ottico utilizzando 0,12 mm forcipe dentato e tagliare con forbici di primavera di Allerød. Nota: In questo momento, la guaina di tessuto intorno al nervo ottico deve essere visibile. Continua a separare la guaina di tessuto lungo la direzione del nervo ottico nella profondità orbitale, fino al totale esposizione del nervo ottico. Mantenere l’area pulita utilizzando tamponi chirurgici per pulire piccole quantità di sangue che derivano dalla rimozione del tessuto. Nota: Ora, il nervo ottico deve essere visibile. Per potervi accedere, rimuovere il fodero meningeo che circonda il nervo senza danneggiare l’arteria oftalmica. Ruotare delicatamente la guaina per esaminare il pattern vascolare del dura ad alto ingrandimento sotto un microscopio operativo. Identificare un’area priva di vasi sanguigni ed eseguire un taglio longitudinale su dura. 13 rip la guaina parallela alla direzione del nervo ottico con una punta d’ago 26G o knifepoint della Sonda chirurgica zaffiro con attenzione, evitando di danneggiare il sistema vascolare con tagli laterali. Nota: Le rimanenze unica che copre il nervo dovrebbero essere l’aracnoide membrane, che è molto sottile e trasparente. Simile al punto 5.2, strappare la membrana aracnoide delicatamente con una punta d’ago 26G o knifepoint della Sonda chirurgica dello zaffiro, parallela alla direzione del nervo ottico. 13 lay il nervo ottico all’interno della scanalatura di strumento dolcemente e con attenzione, conseguente il nervo ottico dorsale è leggermente superiore a bordo testa scanalato. In questo momento, transetto il dorsale del nervo ottico sopra il bordo della piattaforma testa scanalata con una punta ad ago 26G o knifepoint di zaffiro Sonda chirurgica per completare il transection parziale del nervo ottico. 6. Chiusura e recupero direzione mossa lo strumento un poco più profondo verso la posizione verticale del nervo ottico gratuita quest’ultimo. Quindi, rimuovere la testa scanalata dello strumento delicatamente. Cerca di non graffiare i muscoli oculari o altri tessuti per evitare danni extra. Il ceppo del transection parziale del nervo ottico può essere osservato. Sostituire il rectus laterale, fascia e altri tessuti circostanti dell’occhio alle loro posizioni originali. Quindi, suturare il muscolo e gli strati della pelle dell’orbita in sequenza. Se il sanguinamento persiste, delicatamente riempire con un batuffolo di cotone medica prima di chiudere la ferita e mantenere questo per un periodo di tempo. Applicare pomata antibiotica alla ferita per prevenire l’infezione. Turn off l’origine di isoflurano e permettere all’animale di ossigeno respiro per alcuni minuti. Nel processo di rianimazione di ratto, preparare isolamento termico con una stuoia riscaldata oppure coprire la superficie di gabbia con imbottitura asciutto. Coprire gli animali con coperte, per garantire la pervietà delle vie aeree di ratto durante il processo di recupero. Animali casa singolarmente dopo la chirurgia. Somministrare analgesici post-chirurgici secondo le linee guida fornite dalle autorità istituzionali cura degli animali. Monitorare con attenzione gli animali dopo chirurgia.

Representative Results

Per verificare il successo per quanto riguarda l’istituzione di un modello di lesione secondaria con il nuovo approccio operativo utilizzando SSAI (Figura 2A), RGCs retrogradely sono stati etichettati immediatamente dopo l’istituzione del modello. Lo scopo di questa procedura era di etichetta RGCs retrogradely iniettando un colorante tracciante neurale (3% fluoroforo (ad esempio, Fluorogold) in una soluzione salina tampone fosfato sterile) nel collicolo superiore (Figura 2B). Questo approccio produce etichettatura riproducibile di vitali RGCs con piccole variazioni. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 la tintura sarà retrogradely ripreso da RGCs nella retina e costituisce un marcatore per RGCs dal vivo, con gli assoni non transected nell’occhio di destra. Nel frattempo, RGCs corrispondente al nervo ottico parzialmente transected assoni nell’occhio di destra non potrebbero essere etichettati con colorante tracciante (Figura 2). Come un occhio di controllo, l’occhio di sinistra senza operazione, RGCs lungo il nervo ottico della retina sono stati tutti etichettati con il colorante oro fluorescente in modo retrogrado dal collicolo superiore (Figura 2D). Sette giorni dopo il transection parziale del nervo ottico e l’etichettatura retrograda di RGCs, le retine sono state raccolte, corretti, appiattite e montate. Il RGCs con etichetta erano imaged sotto un microscopio a fluorescenza in regioni definite della retina. I risultati di RGCs fluorescenza-etichettati con o senza il transection parziale del nervo ottico sono mostrati nella Figura 3. Solo il RGCs nella retina destra corrispondente alla parte untransected del nervo ottico sono stati etichettati con oro fluorescente, e potrebbe essere un chiaro confine di RGCs senza etichetta e con etichetta visualizzata (Figura 3A, Figura 3B), dimostrando la transazione parziale del nervo ottico. Come un occhio di controllo, tutti i RGCs della fluorescenza della retina ha mostrato occhio sinistro (Figura 3, Figura 3D). Per valutare se il sistema vascolare intorno alla testa del nervo ottico e l’arteria oftalmica che fornisce il sangue per il entoretina sono rimasti feriti e colpite durante l’operazione, il fondo dell’occhio di destra era imaged prima e dopo la chirurgia. Le immagini hanno mostrato il rifornimento di sangue per l’occhio destro (occhio operativa) prima e 1 ora dopo l’operazione. Sangue nelle arterie era adeguata. È stata osservata nessuna ostruzione della vena. Questi risultati hanno indicato che non c’era nessun danno per il sistema di approvvigionamento di sangue durante l’operazione (Figura 4A, Figura 4B). Di conseguenza, il modello di degenerazione secondaria di RGCs è stato stabilito correttamente. Figura 1 : Fotografie di strumento di auto-progettato assistente chirurgico, SSAI. (A) una vista panoramica dello strumento chirurgico, con due parti principali, tra cui un palo di mano e una testa scanalata. Tra di loro, c’è una sezione del giunto con una lunghezza di 50 mm. La lunghezza del palo portatile è 100 mm e il diametro del palo portatile è 9mm. (B) una caratteristica della scanalatura SSAI. La superficie scanalata della testa scanalata è semi-circolare, che permette il nervo ottico porre all’interno di esso, essendo stabilizzato per il transection. La superficie scanalata è con una profondità verticale di 200 µm e una larghezza di 500 µm e una lunghezza di 1.000 µm. La larghezza del bordo della testa scanalata è 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Diagramma schematico di RGC etichettatura sulla retina dopo il transection parziale del nervo ottico di destra con lo strumento di auto-progettato assistente chirurgico (SSAI) e l’etichettatura retrogradely il collicolo superiore con il fluoroforo. (A) la vista chirurgico del nervo ottico di destra parziale transection in ratti con lo strumento di auto-progettato assistente chirurgico (SSAI). (B) dopo la modellazione, RGCs sono stati etichettati retrogradely iniettando un colorante tracciante neurale (colore giallo, 3% fluoroforo in soluzione fisiologica di tampone fosfato sterile) nel collicolo superiore nel cervello. Poiché gli assoni del RGCs risiedono nel collicolo superiore, il colorante tracciante è ripreso da RGCs retrogradely e costituisce un indicatore per le cellule vive. La sezione trasversa nella figura rappresenta una sezione trasversale del nervo ottico. OD, occhio operato; OS, occhio di controllo senza operazione. In (C), solo il RGCs corrispondente alla porzione untransected del nervo ottico sono stati etichettati con fluoroforo. Il blu rappresenta indifferenziati nervi ottici ventrali e la corrispondente RGCs sulla retina; rosso riflette parzialmente transected nervi ottici dorsali e la corrispondente RGCs sulla retina. (D) retinico RGCs dell’occhio sinistro (occhio di controllo) senza l’intervento chirurgico sono stati tutti etichettati dal colorante. Dorsali e ventrali nervi ottici sono stati tutti etichettati dal colorante pure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Modello di micrografie epifluorescenza intera retina del fluoroforo etichettato RGCs 7 giorni dopo aver stabilito il transection parziale del nervo ottico e retrogrado etichettatura del collicolo superiore. Vengono presentati anche i corrispondenti diagrammi schematici di Fluorogold macchiato aree RGC sulla retina. (A) e (C) rappresentano i diagrammi schematici di RGCs nella retina del diritto (operativo) e occhi di sinistra (controllo) dopo l’etichettatura con fluoroforo, rispettivamente. Giallo indica l’area etichettata con il colorante fluorescente di oro. La retina è diviso in parti dorsali, ventrali e centrale. (B) e (D) rappresentare tutta retinica epifluorescenza micrografie ottenute con un microscopio a fluorescenza; giallo rappresenta l’area di RGCs etichettati con fluoroforo. Nell’occhio chirurgico (occhio destro) mostrato in B, la regione senza etichetta rappresenta l’area del RGCs corrispondente al nervo ottico che è parzialmente transected, principalmente sul lato dorsale della retina. L’area con etichettata dal colorante fluorescente oro è l’area di RGCs corrispondente al nervo ottico che non è transected e concentrato soprattutto nel lato centrale e ventrale della retina. Il bounDary fra le zone di senza etichetta e con etichetta RGCs è chiaro. Degenerazione primaria dei corpi RGC sarebbe limitata alla retina dorsale, e tutti i perdita di corpi RGC nelle retine centrale e ventrale potrebbe essere attribuita alla degenerazione secondaria. Microfotografia di (D) intero retinica dell’occhio di sinistra dopo l’etichettatura di RGCs con fluoroforo. La RGCs dell’occhio sinistro controllo senza intervento chirurgico sono stati totalmente macchiati da fluoroforo. Scala bar = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Immagini preoperatoria e postoperatorie del fondo dell’occhio destro ottenute da Fundus camera. (A) immagine del fondo prima della chirurgia occhio destro in ratti, mostrando buon rifornimento di sangue del fundus, riempimento arterioso e nessun ritorno venoso o ostruzione, che indica un sistema di alimentazione buona sanguigno retinico. (B) immagine del fondo dell’occhio destro 1 ora dopo l’intervento chirurgico. Non confrontato con l’immagine preoperatoria del fondo, i cambiamenti significativi sono stati osservati nella vascolarizzazione retinica, che indica che il sistema di approvvigionamento di sangue del bulbo oculare non è stato colpito durante il processo di modellazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Fotografie di nervo ottico retrobulbar e arteria oftalmica situato sulla guaina meningea, catturata attraverso il metodo chirurgico. Dopo aver completamente rimosso la lunghezza mirata del nervo ottico, l’arteria oftalmica (punta di freccia) concomitante con il fodero meningeo del nervo ottico è stata esposta e in parallelo al nervo ottico. Scala bar = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Diagramma schematico delle posizioni di degenerazione primaria e secondaria nel nervo ottico. Incisione parziale del nervo ottico è stata ottenuta utilizzando lo strumento di auto-progettato assistente chirurgico (punta di freccia). Gli assoni in siti direttamente danneggiati (sito di taglio dorsale del nervo ottico nella sezione trasversa in grigio) subiscono degenerazione primaria, mentre quelli in siti indirettamente danneggiati (zone centrali e ventrale del nervo ottico nella sezione trasversa in giallo) subire la degenerazione secondaria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Procedura operativa

Ci sono alcuni punti degni della comunicazione nel processo di costruzione del modello. Al punto 4.2, il movimento chirurgico deve essere eseguito con attenzione per evitare di danneggiare il sistema vascolare sopra il muscolo sottofasciale. Soprattutto, quando si taglia la fascia sottocutanea in canthus laterale esterno, forcipe dentato tagliente deve essere utilizzato per tirare verso l’alto la fascia sottocutanea sulla superficie fascia verticale; la fascia dovrebbe essere tagliata con Allerød forbici di primavera per evitare di danneggiare la vena orbitale al canthus esterno, che può provocare il guasto di modello di eccessivo sanguinamento. Passo 4.3 ha il vantaggio di potenzialmente prevenire sanguinamento durante la rimozione direttamente dai vasi sanguigni. Nella separazione orbitali muscoli step 4.5, il motivo per picking forcipe dentato sharp ma non Allerød forbici di primavera sono di evitare lo spurgo continuo e l’emorragia. I muscoli sono senza mezzi termini separati su entrambi i lati in direzione perpendicolare alla incisione della fascia di pelle; nel frattempo, i muscoli profondi dell’orbita sono tese verso l’esterno e marginalmente. Questa procedura vi svelerà le parti più profonde della cavità orbitale, fornendo una finestra più grande chirurgica e consentendo l’accesso senza ostacoli ai tessuti sovrapponendo il nervo ottico. Nelle procedure di cui sopra, se l’emorragia si verifica, pressione deve essere applicato utilizzando sterile chirurgico o tamponi di cotone. Sanguinamento minore si fermerà dopo alcuni secondi di questa procedura. Lo scopo di passaggio 4.6 è quello di facilitare le operazioni di follow-up per rimuovere facilmente alcuni muscoli grassi e separati nel cono muscolare orbita per esporre il nervo ottico lungo la direzione del nervo ottico nella profondità orbitale.

Le parti più critiche del protocollo attuale sono passi 5.1-5.6. È importante non danneggiare il sistema vascolare intorno alla testa del nervo ottico. Il nervo ottico dovrebbe essere parzialmente transected almeno 1.5-2.0 mm dalla parte posteriore dell’occhio, per evitare di danneggiare l’arteria oftalmica che penetra il nervo all’interno di 1 mm dell’occhio e fornisce il sangue alla retina interna. Lo scopo di tagliare il rectus laterale è quello di ottenere la migliore esposizione del nervo ottico come rectus laterale è vasto e ovviamente blocca la visualizzazione del nervo ottico. Nel frattempo, per evitare la rimozione dell’arteria oftalmica che è associato con il fodero meningeo (Figura 5), è necessario separare e dissociare il dura intorno al nervo ottico ed esaminare il pattern vascolare della guaina meningea, usando pinze per ruotare delicatamente la guaina. Inoltre, dovrebbe essere identificata un’area priva di vasi sanguigni, permettendo un taglio longitudinale nel fodero meningeo. Inoltre è necessario mantenere una distanza di lavoro piccolo dalla parte posteriore dell’occhio, per evitare la porzione del dura che è strettamente collegata con l’arteria oftalmica. La retina è normalmente trasparente, e vasi sanguigni può essere chiaramente delimitati. In caso di alimentazione danneggiati sanguigno retinico, la retina è degenerata, che conduce ad un aspetto fioccoso bianco latteo. La cavità dell’umor vitreo dell’occhio e la lente in genere diventerà nuvoloso pure, con occhi in diminuzione dimensione nel corso del tempo. In questo studio, immagini preoperatoria e postoperatorie del fondo non confermato nessun danno per il rifornimento di anima del fondo nel modello dopo aver applicato la procedura descritta sopra.

Inoltre, particolare attenzione è necessaria in diversi passaggi di questo modello. Quando si utilizza forcipe curvo e tagliente-dentato o altri strumenti chirurgici per esporre il nervo ottico, il chirurgo dovrebbe evitare una forza eccessiva, altrimenti si potrebbe danneggiare il nervo ottico, il bulbo oculare o arteria oftalmica, conseguente ferita primaria e ischemia retinica. Inoltre, i vasi sanguigni che circondano l’occhio non deve essere danneggiati, per evitare il sanguinamento prolungato, che potrebbe portare al fallimento di modellazione. La SSAI utilizzati in questo esperimento richiede l’utilizzo di delicato. Quando il nervo ottico viene posizionato all’interno della scanalatura dello strumento, è necessario essere ben avvitate per garantire buona consistenza e ripetibilità di ogni modello animale del nervo ottico e la superficie scanalata. Con pratica, la procedura chirurgica completa può essere completata entro 15-20 minuti per l’occhio, dopo aver effettuati i tagli di ingresso iniziale.

Wang et al. 19 pubblicato un simile modello animale del transection parziale del nervo ottico stabilito utilizzando un Amputatore quantitativa del nervo ottico. Le procedure chirurgiche comprende: 1) taglio apart canthus esterno, sospensione e fissaggio al palpebrale superiore; 2) esplorare il nervo ottico e transecting la porzione superiore del nervo ottico usando l’Amputatore; e 3) sutura della congiuntiva e della pelle. Anche se la procedura chirurgica è stata relativamente semplice, i seguenti problemi sono stati rilevati durante l’operazione. Anche se canto laterale incisione potrebbe esporre certo spazio per operazione, c’era una necessità inevitabile di costantemente allungare il bulbo oculare al fine di esporre il fodero del nervo ottico retrobulbar, soprattutto quando i chirurghi voluto esporre un retrobulbar più lungo fodero del nervo ottico per agevolare ulteriormente la guaina di isolamento; la forza per l’allungamento del bulbo oculare era maggiore, che rischia di causare lesioni di trazione diretta del bulbo oculare e del nervo ottico. Nessuna attenzione speciale era pagata ai vasi sanguigni che potrebbe essere tagliati insieme al fodero del nervo ottico, e danni ai vasi sanguigni sono probabili che portano alla creazione di modello fallito. Le principali procedure di lesione secondaria modello descritto in questo documento sono: un nuovo agente avvicinarsi da parete orbitale laterale del bulbo oculare per accedere direttamente al nervo ottico retrobulbar circondato dal cono muscolo orbitale, evitando ferita primaria per la bulbo oculare e del nervo ottico, quando tirando verso il basso o verso il lato nasale laterale del bulbo oculare. Questo nuovo approccio operativo aumenta lo spazio di intervento chirurgico durante la modellazione e consente facile isolamento del fodero meningeo, che è strettamente associato con l’arteria oftalmica, prima il transection parziale del nervo ottico. Il transection parziale del nervo ottico è stato effettuato con uno strumento chirurgico self-progettato, che è conveniente e riutilizzabili, riducendo il costo complessivo di modellazione. Struttura orbitale del ratto è diverso da quelli degli altri mammiferi, con l’orbita più vicina al canthus e nessuna struttura ossea, ma coperto con i muscoli. L’approccio chirurgico potrebbe raggiungere la parte posteriore del bulbo oculare senza la necessità di distruggere l’osso orbitale e il periostio. Attraverso la rigorosa Disinfezione preoperatoria e postoperatoria profilassi antibiotica, infezione, infiammazione ed edema sono stati notevolmente ridotti.

Self-progettato strumento assistente chirurgico

Modello del ratto del transection parziale del nervo ottico è stato stabilito utilizzando lo strumento di auto-progettato assistente chirurgico, cui caratteristiche principali sono come segue. Si può assistere in quantitativi parziali transection del nervo ottico esposto al bordo scanalato, anche garantendo la coerenza di transection tra diversi animali. Abbiamo testato e verificato la ripetibilità di stabilimento modello con SSAI. Il massimo coefficiente di variazione era 1,85%, con un 0,67% di valore medio ± 0.44 %. 20 questi risultati indicano che la SSAI potrebbe essere utilizzato per stabilire modelli di transection parziale del nervo ottico, con riproducibilità soddisfacente e ONUiformity.

Larghezza di superficie scanalata e il design del semicerchio della superficie interna della scanalatura può avere un effetto più fisso sul nervo ottico e rendere la superficie scanalata e del nervo ottico collegare più strettamente, anche diminuendo errori sperimentali e reazioni avverse. Il lato scanalato consente una migliore protezione del nervo ottico nella scanalatura durante l’operazione, che non danneggia il nervo ottico nella scanalatura, indipendentemente dalla nitidezza del cutter. Un altro vantaggio del bordo scanalato è prevenzione delle lesioni di schiacciamento durante il transection del nervo ottico.

È opportuno per operare nello spazio profondo e stretto. Anche se il nuovo approccio operativo è stato ampliato, il percorso rimane profondo e il Polo tenuto in mano e la sezione del giunto può essere utilizzati per posizionare la testa scanalata facilmente sotto il fodero del nervo ottico per eseguire operazioni di follow-up. Quando lo strumento viene utilizzato per il funzionamento, una vasta gamma di frese può essere utilizzata per il transection, ad es. una punta ad ago 26 G. Anche un coltello di zaffiro Sonda chirurgica può essere selezionato per evitare contusioni e lesioni causate da forbici di schiacciamento. Groove superfici possono essere fatto in diverse profondità verticale per completare i vari gradi di taglio del nervo ottico.

Rispetto l’Amputatore di Wang et alla SSAI ha una struttura più semplice. Inoltre, il passo di taglio è più conveniente utilizzando la SSAI, con maggiore coerenza e ripetibilità del modello animale. Infine, la gamma di strumenti applicabili per il taglio con la SSAI è anche più ampia. In conclusione, SSAI, che rende uniforme e quantitative incisioni del nervo, può servire come uno strumento efficace per stabilire modelli di ratto per valutare il transection del nervo ottico.

Caratteristiche del modello di Transection parziale del nervo ottico del ratto

Il modello di transection parziale del nervo ottico è utile per valutare la degenerazione secondaria a RGCs. Il potenziale merito di questo modello è la capacità di separare accuratamente primario da degenerazione secondaria in situ, sia nel nervo ottico e della retina. I nervi ottici ventrali e centrali erano più suscettibili al danno secondario dopo il transection parziale (circa 1/3 o 1/2) del nervo ottico dorsale (Figura 6). Nella retina, la posizione regionale delle lesioni primarie e secondarie di RGCs dovrebbe basarsi sulla topografia del nervo ottico corrispondente a RGCs retinica dopo il transection parziale. Se l’intera retina del ratto è diviso in dorsale (superiore) e parti ventrali (inferiore), le lesioni di primarie e secondarie sono presenti in entrambe le parti. Tuttavia, basato sul rapporto tra RGCs sulla retina e l’assone del nervo ottico, RGC morte nella retina ventrale deve principalmente attribuita alla lesione secondaria (Figura 3). 12 , 22 , 23 i vantaggi di questo modello: strumento semplice e facile da gestire con procedure standard; Nessun effetto sui vasi oftalmici; buona riproducibilità e stabilità. Questa tecnica potrebbe essere usata a transfect RGCs da questo approccio operativo salvaspazio applicando short interfering RNA (siRNA), plasmidi, e vettori virali per il parziale del nervo ottico del ceppo; Inoltre, i reagenti potrebbero essere collocati sul ceppo per il trattamento selettivo o etichettatura di RGCs parziale del nervo ottico.

Lesioni complessive, primarie e secondarie di RGCs coesistevano dopo il transection parziale del nervo ottico in questo modello animale, con un chiaro confine nella retina tra i tipi di due lesioni. Anche se l’associazione di RGC posizione sulla retina e nervo ottico assoni ha bisogno di ulteriori indagini per una più precisa distinzione, questo approccio operativo salvaspazio amplia la gamma di applicazione del modello e permette ai ricercatori di esplorare la meccanismi di lesione secondaria in RGCs in modo nuovo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla Beijing Natural Science Foundation (7152038), i fondi di ricerca fondamentali per le Università centrale di Central South University (2016zzts162) e il Science Research Foundation di Aier occhio ospedale gruppo (Grant No. AF156D11). Infine, Fancheng Yan grazie Yiping Xu per la preziosa collaborazione nel corso degli anni.

Materials

Animal Aneathesia Ventilator System MIDMARK Matrx VMR
Isoflurane RWD Life Science Co. R510-22
Surgical Microscope Leica AG, Heerbrugg, Switzerland M620 F20
Tobramycin Eye ointment Alcon H20110312
Fluorogold Biotium 80014
Iris scissors 66vision Co. 54026
Vannas spring scissor 66vision Co. 54137B
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps  66vision Co. 53329A
Sharp-curved forceps 66vision Co. 53324A
Sapphire surgical probe 66vision Co. 50205TA
26G needle tip Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. 3151474
10 μl Hamilton Syringe Hamilton Co. 80030
5-0 non-absorbable suture Johnson & Johnson International Co. W580
Chlorhexidine Sigma-Aldrich 282227
Stereotaxie apparatus RWD Life Science Co. 68026
Retinal Imaging System OptoProbe Ltd. OPTO-RIS
RetCamII wide field imaging system Clarity Medical Systems,Inc. RetCamII
Fluorescence microscope Leica Microsystems Inc. DM6000
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Yan, F., Guo, S., Chai, Y., Zhang, L., Liu, K., Lu, Q., Wang, N., Li, S. Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (128), e56272, doi:10.3791/56272 (2017).
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