JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Gedeeltelijke oogzenuw transect bij ratten: een Model tot stand gebracht met een nieuwe operationele aanpak om te beoordelen van secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen

Published: October 15, 2017
doi:
10.3791/56272
, , , , , , ,
1Aier School of Ophthalmology,Central South University, Changsha, China, 2Institute of Immunology,Tsinghua University School of Medicine, Beijing, China, 3Beijing Tongren Eye Center,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China, 4Beijing Institute of Ophthalmology,Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China

Summary

Secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen (RGCs) komt vaak voor bij glaucoom. Deze studie beschrijft een innovatieve operationele aanpak voor gedeeltelijke oogzenuw transect. Het gebruik van deze ruimtebesparende operationele aanpak strekt zich uit de modellenreeks van de toepassing en kunt verkenning van secundaire schade mechanismen in RGCs op een nieuwe manier.

Abstract

Eerdere studies hebben aangetoond dat de secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen (RGCs) treedt meestal op in glaucoom. Gedeeltelijke oogzenuw transect wordt beschouwd als een nuttig en reproduceerbare model. In vergelijking met andere oogzenuw letsel modellen vaak gebruikt voor de beoordeling van secundaire degeneratie, bijvoorbeeld volledige oogzenuw transect en oogzenuw crush modellen, de gedeeltelijke oogzenuw transect model is superieure zoals het onderscheidt primaire van secundaire degeneratie in situ. Dus, het dient als een uitstekend hulpmiddel voor de beoordeling van secundaire degeneratie. Deze studie beschrijft een nieuwe operationele aanpak van gedeeltelijke oogzenuw transect door rechtstreeks toegang tot het gebied van de oogzenuw retrobulbaire door de orbitale laterale wand van de oogbol. Bovendien presenteren wij een nieuw ontworpen, low-cost chirurgische instrument om te helpen met transect. Zoals aangetoond door de representatieve resultaten in de grens van primaire en secundaire schade gebieden te onderscheiden, het instrument en de nieuwe aanpak zorgt voor een hoge efficiëntie en stabiliteit van het model door het verstrekken van voldoende ruimte voor chirurgische ingreep. Dit maakt op zijn beurt het gemakkelijk kan worden gescheiden van de meningeal van de schede en oogheelkundige schepen van de oogzenuw voordat transect. Een bijkomend voordeel is dat deze ruimte besparende operatieve benadering de onderzoekers kunnen toedienen van drugs, vervoerders of selectieve regering van Cambodja verklikstoffen aan de stronk van de gedeeltelijk transected oogzenuw verbetert, waardoor de verkenning van de mechanismen achter secundaire schade in RGCs, op een nieuwe manier.

Introduction

Secundaire degeneratie treedt meestal op in het centrale zenuwstelsel (CNS) na traumatische letsels en volgende acute en chronische neurodegeneratieve ziekten. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de dood van zenuwcellen en gliacellen als een vroege gevolg van primaire pathologische gebeurtenissen heet primaire degeneratie, terwijl secundaire degeneratie naar de dood van zenuwcellen en gliacellen, die niet verwijst of slechts gedeeltelijk worden beïnvloed door primaire schade. Secundaire degeneratie van RGCs is ook van mening dat het optreden in glaucoom. 6 Yoles et al. 7 bevestigd dat de secundaire schade van RGCs zich in de oogzenuw letsel model voordoet. Zij toonden aan dat neuronen waarvan axonen raakten niet gewond na een acute schade uiteindelijk als gevolg van degeneratieve omgeving ontaarden zal geproduceerd door de schade rond deze axonen. Deze secundaire degeneratie is van invloed op de neuronen in een progressieve mode gerelateerde aan de ernst van de schade. Tot nu toe, blijven de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regering van Cambodja schade in glaucoom onduidelijk, vooral die met betrekking tot secundaire schade, wat in onvoldoende klinische behandeling resulteert. 8 , 9 , 10 Welnu, het is noodzakelijk om te verkennen van de onderliggende mechanismen van secundaire degeneratie van RGCs tijdens de ontwikkeling van glaucoom. 11 oprichting van diermodellen van secundaire schade die kwantitatief de grootte, verspreiding en mechanisme van secundaire degeneratie RGCs beoordelen kunnen trekt steeds meer aandacht van wetenschappers bestuderen van secundaire schade van RGCs.

Ter verduidelijking van dit probleem, werd een rat PONT model opgericht door Levkovitch-Verbin et al. 12 te evalueren van axonale schade veroorzaakt degeneratie en de dood van RGCs. Dit model wordt beschouwd als een goed instrument voor het verkennen van de mechanismen van secundaire degeneratie en het identificeren van de potentiële neuroprotectieve agenten. Het instrument gebruikt voor het genereren van dit model van secundaire schade is een diamant mes met een schaal tot transect kwantitatief door het instellen van de diepte van amputatie via de knop van de wijzerplaat, om een kwantitatieve transect van de oogzenuw. Het chirurgische pad benadert vanuit de oogbol opwaartse of tijdelijke bindvlies. Tijdens het operatieve proces, kunnen het netvlies en de optische zenuwen worden beïnvloed door de kracht van pincet, die op zijn beurt primaire letsel kunnen veroorzaken. Nog belangrijker, als gevolg van de beperkte ruimte van de blootgestelde oogzenuw is het moeilijk te scheiden van de meningeal schede voordat de incisie. Daarom is het mogelijk om schade van de oogheelkundige schepen tijdens gedeeltelijke oogzenuw transect, wat in netvlies ischemie en het falen van het model resulteert. Bovendien, de diamant mes is kostbaar, en elk gebruik vermindert de scherpte van de tip. Dit kan op zijn beurt gevolgen hebben voor de diepte en het effect van het modelleren van.

Het model van secundaire degeneratie RGCs beschreven in deze studie werd verkregen door middel van een nieuwe operationele aanpak uit de laterale orbitale wand van de oogbol. Deze nieuwe operationele aanpak rechtstreeks toegang heeft tot de retrobulbaire oogzenuw omringd door de orbitale spier kegel, vermijden van primaire schade aan de oogbol en de oogzenuw bij trekken naar beneden of naar de nasale laterale zijde van de oogbol. Dit ook verhoogt de ruimte van de chirurgische ingreep tijdens model vestiging en kunt meningeal schede isolatie vóór gedeeltelijk transecting de oogzenuw. Het is belangrijk op te merken dat de onbedoelde betrokkenheid en letsel van oogheelkundige schepen tot het falen van het model leiden kunnen. Het model maakt bovendien een follow-up beoordelingvan de transfected cellen, drugs en reagentia op de stomp van de gedeeltelijk transected oogzenuw. De zelf ontworpen chirurgische instrument is goedkoop en kan gebruikte meerdere keren, waardoor de kosten van de modellering. Het model van de secundaire schade van RGCs opgericht door deze methode bleek te hebben goede reproduceerbaarheid en stabiliteit.

Protocol

procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de institutionele dier zorg en Comité (IACUC) van de hoofdstad Medizinische Universität gebruiken. Alle chirurgische instrumenten en oplossingen werden gesteriliseerd voorafgaand aan de operatie te beperken van microbiële infectie. Opmerking: het chirurgische protocol omvatte vijf delen, namelijk anesthesie, chirurgische aanpak, evaluatie van de oogzenuw, sluiten, en herstel. Om te helpen met gedeeltelijke kwantitatieve transect van de oogzenuw, is een nieuwe, goedkope chirurgische instrument ontworpen. Alle procedures werden uitgevoerd na de ethische regels en de chirurgische techniek. 1. chirurgische techniek uitvoeren van experimenten met behulp van de aseptische techniek; protocollen voor dierlijk gebruik moeten specifieke instelling. Sterilize instrumenten en materialen (oplossingen teststoffen, tracers, naalden, etc.) om te voorkomen dat infectie en negatieve effecten op het welzijn van dieren, alsmede mogelijke negatieve gevolgen voor het onderzoek contact levende weefsels komen . 2. Verdoving verdoving SD ratten met behulp van een veterinaire Isofluraan vaporisator systeem. Medische kwaliteit zuurstof gebruiken met een snelheid van 1 L/min voor het verdampen van het gas Isofluraan. Plaats het dier in het vak gekoppelde anesthesie en Isofluraan uitgevoerd bij een concentratie van 4,5% tot langzame ademhaling en dierlijke sedatie. De gasstroom naar de bijlage gasmasker en plaats het dier op de operatie tafel. Lager de concentratie van Isofluraan op 2% en monitor narcose. Grotere dieren (> 300 g) wellicht een hogere concentratie van Isofluraan. Monitor verdoving tijdens de operatie, met Isofluraan dosering dienovereenkomstig aangepast. Voortdurend evalueren van de diepte en de snelheid van de ademhaling en teen snuifje evaluatie elke 5 min, uit te voeren om ervoor te zorgen het ontbreken van diepe pijn. Zodra de operatie is voltooid, de Isofluraan uitschakelen en laat adem zuurstof het dier gedurende enkele minuten voorafgaand aan de verwijdering uit de tabel van de operatie. Handhaven van de lichaamstemperatuur door die betrekking hebben op het dier met een chirurgische deken en/of met behulp van een regelbare verwarming deken tijdens chirurgie. 3. Zelf ontworpen chirurgisch assistent Instrument (SSAI) gebruik een SSAI van roestvrij staal, en voornamelijk gemaakt bestaat uit een hand-held paal (lengte 100 mm, diameter, 9 mm) en een gegroefde kop ( Figuur 1). De gegroefde oppervlak van de gegroefde kop is semi-circulaire, met verticale diepte, breedte en lengte van 200 µm, 500 µm en 1.000 µm, respectievelijk. Tussen de twee delen is er een gezamenlijke gedeelte met een lengte van 50 mm. De gegroefde kop ' s rand is 300 µm breed. Opmerking: De gegroefde oppervlak maakt het mogelijk de stabilisatie van de ventrale oogzenuw voor transect. De dorsale oogzenuw wordt blootgesteld aan de buitenkant van de groef wanneer de ventrale zijde van de oogzenuw legt binnen Ondertussen kan de dorsale oogzenuw blootgesteld aan de gegroefde rand worden verbeelde als verticale snijden wordt uitgevoerd. De ventrale oogzenuw gelegd binnen de gegroefde oppervlak wordt beschermd door de gegroefde kop ' s rand. Bereiken van primaire letsel in RGCs overeenkomt met de oogzenuw kwantitatief verbeelde axonen (dorsale zijde), terwijl de secundaire schade zou worden uitgevoerd in RGCs overeenkomt met untransected oogzenuw axonen (ventrale zijde) zonder directe schade. 4. Chirurgische aanpak de rechterkant van de rat naar boven op de chirurgische tafel met hoofd geconfronteerd met de chirurg plaats. De juiste baan in het midden van het gezichtsveld van de chirurgische aanpassen. Vervolgens, schoon het gebied van de incisie meerdere keren langs de laterale canthus aan de externe akoestische foramen van de juiste orbitale huid, 0,5% chloorhexidine in 75% ethanol toe te passen. Verwijderen van de vacht tussen de laterale canthus aan de externe akoestische foramen met behulp van iris schaar. Maken een huid incisie iris schaar langs de laterale canthus aan de externe akoestische foramen met een lengte van 0,5 tot 1 cm. Vervolgens, knijpen de fascia en trek een driehoekige wig omhoog maken met een getande Tang 0,12 mm. Invoegen van het onderste blad van Vannas voorjaar schaar in het gebied van de incisie en opengesneden de fascia in dezelfde richting schuintrekken. Knippen de fascia met Vannas voorjaar schaar en bloot de orbitale ader. Gebruik pincet sharp-getande klem van de zijkanten van de orbitale ader en botte open beide zijden van de incisie. Plaats de orbitale ader in de chirurgische richting van het oppervlak van de orbitale spier, die is gepositioneerd om follow-up werking te vergemakkelijken en om te voorkomen dat chirurgie gerelateerde bloeden van de orbitale ader. Gebruik van iris schaar om te knippen het laterale canthus uit elkaar langs de lijn van de incisie volledig bloot het gezichtsveld voor de botte dissectie van de orbitale spieren tijdens volgen recht omhoog Ga naar de map van de subfascial orbitale spier klem en botte verticaal in de richting van de huid en fascia incisie scheiden. Aparte langs kanten geleidelijk aan het bereiken van de orbitale diepte, tot uiterlijk van het orbitale vetweefsel. Na blootstelling van de orbitale vetweefsel, wijzigt u de rat hoofd richting uit geconfronteerd met de chirurg verticaal aan de rechterkant van de chirurg. Ondertussen houden het gebied voortdurend vochtig met behulp van chirurgische of katoen swabs met steriel PBS. Deze procedure zorgt voor een heldere visie op het chirurgische gebied, terwijl het weefsel vochtig en zacht. 5. Toegang tot de oogzenuw afgesneden orbitale vetweefsel die betrekking hebben op de orbitale spier kegel rond de oogzenuw in de orbitale holte. Dit zorgt voor een betere blootstelling voor de juiste chirurgische aanpak. Houd resectie van het vetweefsel beperkt om te voorkomen dat volgehouden bloeden. Knippen het vetweefsel, bloot de laterale rectus. Klem de laterale rectus naar buiten, en snijd het vervolgens met Vannas voorjaar schaar. Als het vetweefsel onder de laterale rectus blijft, pull up het vet de oogzenuw 0,12 mm gebruik bevolkingsspreiding toothed pincet en knippen met een schaar van Vannas voorjaar. Opmerking: Op dit moment, de schede van weefsel rond de optische zenuw moet worden weergegeven. Doorgaan om te scheiden van de schede van weefsel in de richting van de oogzenuw in de orbitale diepte, tot de totale blootstelling van de oogzenuw. Houden van het gebied schoon met behulp van chirurgische swabs tot schone kleine hoeveelheden bloed die uit weefsel verwijderen voortvloeien. Opmerking: Nu, de oogzenuw zichtbaar moeten zijn. Om te openen, verwijder de meningeal schede rond de zenuw zonder beschadiging van de oogheelkundige slagader. Zachtjes draaien de schede te onderzoeken van de vasculaire patroon van de dura bij hoge vergroting onder een operationele Microscoop. Identificeren een gebied verstoken van bloedvaten, en het uitvoeren van een longitudinaal knippen op de dura. 13 rip de schede parallel aan de richting van de oogzenuw met een 26G naald tip of bosrand van sapphire chirurgische sonde zorgvuldig, het vermijden van schade aan de therapieën met laterale bezuinigingen. Opmerking: De enige overgebleven die betrekking hebben op de zenuw moet de arachnoideavilli membrane, die zeer dun en transparante is. Vergelijkbaar met de stap 5.2, rip de arachnoideavilli membraan zachtjes met een 26G naald tip of bosrand van sapphire chirurgische sonde, parallel aan de richting van de oogzenuw. 13 leggen de oogzenuw binnen de groef instrument zacht en voorzichtig, resulterend in de dorsale oogzenuw wordt iets hoger dan de gegroefde hoofd rand. Op dit moment transect de dorsale oogzenuw boven de rand van de gegroefde hoofd platform met een 26G naald tip of bosrand van sapphire chirurgische sonde te voltooien gedeeltelijke oogzenuw transect. 6. Sluiten en Recovery zet het instrument een beetje dieper naar de verticale richting van de oogzenuw naar de laatste gratis. Verwijder vervolgens voorzichtig de gegroefde kop van het instrument. Probeer niet te krabben het oogbeschadigingen en/of spieren of andere weefsels om extra schade te voorkomen. De stronk van gedeeltelijke oogzenuw transect waarneembaar. Vervangen door het laterale rectus, fascia en andere omliggende weefsels van het oog naar hun oorspronkelijke posities. Suture dan de spier en de huidlagen van de baan in de juiste volgorde. Als bloeden aanhoudt, voorzichtig vullen met een medische katoenen bal vóór het sluiten van de wond, en dit te handhaven voor een periode van tijd. Toepassing van antibiotica zalf op de wond om infectie te voorkomen. Beurt uit de bron Isofluraan en toestaan dat het dier aan adem zuurstof gedurende enkele minuten. In het proces van rat reanimatie, bereiden van thermische isolatie met een verwarmde mat, of betrekking hebben op het oppervlak van de kooi met droge opvulling. Dekking van de dieren met dekens, om de rat airway bij tijdens het herstelproces. Huisdieren individueel na de operatie. Post chirurgische pijnstillers volgens de richtlijnen door institutionele dierenverzorgers autoriteiten te beheren. Zorgvuldig toezicht houden op dieren na chirurgie.

Representative Results

Om te controleren of succes met betrekking tot de oprichting van een secundaire schade model met de nieuwe operationele aanpak met behulp van SSAI (figuur 2A), waren RGCs retrogradely label onmiddellijk na de vaststelling van het model. Het doel van deze procedure moest label RGCs retrogradely door het injecteren van een neuraal tracer kleurstof (3% fluorophore (bijvoorbeeldFluorogold) in een steriele fosfaat buffer zoutoplossing) in de superieure colliculus (figuur 2B). Deze aanpak levert reproduceerbare labeling van levensvatbare RGCs met weinig variatie. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 de kleurstof zal retrogradely worden overgenomen door RGCs in het netvlies en vormt een marker voor levende RGCs, met de axonen niet verbeelde in het rechteroog. Ondertussen, RGCs overeenkomt met de gedeeltelijk transected oogzenuw axonen in het rechter oog niet kunnen worden aangeduid met tracer kleurstof (figuur 2C). Als een controle-oog, het linker oog zonder operatie, RGCs langs de oogzenuw van het netvlies waren alle gelabeld met de fluorescerende kleurstof voor goud op een natuurlijke manier uit de superieure colliculus (figuur 2D). Zeven dagen na gedeeltelijke oogzenuw transect en retrograde etikettering van RGCs, werden het netvlies geoogst, vaste, afgevlakt en gemonteerd. De gelabelde RGCs waren beeld onder een fluorescente microscoop in bepaalde regio’s van het netvlies. De resultaten van de fluorescentie-label RGCs met of zonder gedeeltelijke oogzenuw transect worden weergegeven in Figuur 3. Alleen de RGCs in de juiste netvlies die overeenkomt met het untransected gedeelte van de optische zenuw waren gelabeld met de fluorescerende goud, en een duidelijke grens van labelloze en gelabelde RGCs kon worden gevisualiseerd (figuur 3A, figuur 3B), het bewijs van de gedeeltelijke transactie van de oogzenuw. Als een besturingselement oog, alle RGCs van de linker oog netvlies bleek fluorescentie (Figuur 3 c, 3D figuur). Om te beoordelen of de therapieën rond het hoofd van de oogzenuw en de oogheelkundige slagader die bloed naar de entoretina levert waren gewond en beïnvloed tijdens de operatie, de fundus rechteroog was beeld vóór en na de operatie. De beelden bleek bloedtoevoer naar het rechter oog (operatieve oog) vóór en 1 uur na operatie. Bloed in de slagaders volstond. Geen obstructie van de ader werd waargenomen. Deze bevindingen aangegeven dat er geen schade aan de bloed-systeem tijdens de operatie (figuur 4A, figuur 4B was). Dus, het model van de secundaire degeneratie van RGCs werd gebracht. Figuur 1 : Foto’s van zelf ontworpen chirurgisch assistent instrument, SSAI. (A) een panoramisch zicht op de chirurgische instrument, met twee delen, met inbegrip van een hand-held paal en een gegroefde kop. Daartussen is er een gezamenlijke sectie met een lengte van 50 mm. De lengte van de hand-held paal is 100 mm en de diameter van de hand-held paal is 9 mm. (B) een functie van de SSAI groef. De gegroefde oppervlak van de gegroefde kop is semi-circulaire, waarmee de oogzenuw te leggen binnen, wordt gestabiliseerd voor transect. De gegroefde oppervlak is met een verticale diepte van 200 µm en een breedte van 500 µm en een lengte van 1.000 µm. De breedte van de rand van de gegroefde kop is 300 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Schematisch diagram van de regering van Cambodja etiketten op het netvlies na gedeeltelijke transect van de juiste oogzenuw met het instrument zelf ontworpen chirurgisch assistent (SSAI) en retrogradely het labelen van de superieure colliculus met de fluorophore. (A) de chirurgische weergave van gedeeltelijke juiste oogzenuw transect bij ratten met het instrument zelf ontworpen chirurgisch assistent (SSAI). (B) na modellering, RGCs waren gelabeld retrogradely door het injecteren van een neuraal tracer kleurstof (gele kleur, 3% fluorophore in een steriele fosfaat buffer zoutoplossing) in de superieure colliculus in de hersenen. Aangezien de axonen van RGCs in de superieure colliculus woont, de tracer kleurstof wordt in beslag genomen door RGCs retrogradely en vormt een marker voor levende cellen. Het transversale gedeelte in de figuur vertegenwoordigt een dwarsdoorsnede van de oogzenuw. OD, bediende oog; OS, controle ogen zonder operatie. In (C), werden alleen de RGCs die overeenkomt met het untransected gedeelte van de oogzenuw aangeduid met fluorophore. Blauw staat voor voorvoeten en ventrale optische zenuwen en de bijbehorende RGCs op het netvlies; rood weerspiegelt gedeeltelijk verbeelde dorsale optische zenuwen en de bijbehorende RGCs op het netvlies. (D) de retinale RGCs van het linkeroog (controle oog) zonder de chirurgische procedure werden alle label van de kleurstof. Dorsale en ventrale optische zenuwen waren alle label van de kleurstof zo goed. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Hele netvlies epifluorescence microfoto van fluorophore label RGCs 7 dagen na het instellen van de gedeeltelijke oogzenuw transect model en retrograde labeling van de superieure colliculus. Het bijbehorende schema’s van de Fluorogold gebieden van de regering van Cambodja op het netvlies gekleurd worden ook gepresenteerd. (A) en (C) vertegenwoordigen de schema’s van RGCs in het netvlies van het recht (operatieve) en links (control) ogen na labelen met fluorophore, respectievelijk. Geel geeft het gebied gelabeld met de fluorescerende kleurstof voor goud. Het netvlies bestaat uit de dorsale en ventrale centrale delen. (B) en (D) vertegenwoordigen hele netvlies epifluorescence microfoto verkregen onder een fluorescentie Microscoop; geel staat voor het gebied van RGCs aangeduid met fluorophore. In de chirurgische oog (rechteroog) weergegeven in B, vertegenwoordigt de labelloze regio het gebied van RGCs overeenkomt met de oogzenuw, die gedeeltelijk is verbeelde, voornamelijk aan de dorsale zijde van het netvlies. De streek aangeduid door de gouden fluorescente kleurstof is het gebied van RGCs overeenkomt met de oogzenuw die niet verbeelde en vooral geconcentreerd in de Centraal en ventrale zijde van het netvlies. De bounDary tussen de gebieden van labelloze en gelabelde RGCs is duidelijk. Primaire degeneratie van de regering van Cambodja organen zou worden beperkt tot de dorsale netvlies, en alle verlies van organen van de regering van Cambodja in het midden- en buikvinnen netvlies kan worden toegeschreven aan secundaire degeneratie. (D) hele retinal gekleurd van het linkeroog na het labelen van RGCs met fluorophore. De RGCs van het oog van de linker control zonder chirurgische ingreep werden volledig gekleurd door fluorophore. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Preoperatieve en postoperatieve beelden van de fundus van het rechteroog verkregen door de camera van de Fundus. (A) afbeelding van de fundus voordat de juiste oogchirurgie bij ratten, toont goede bloedvoorziening van de maagwand, arteriële vullen, en geen veneuze return of obstructie, geeft een goede retinale bloed-systeem voor energievoorziening. (B) afbeelding van de fundus van het rechteroog 1 uur na de operatie. Vergeleken met de preoperatieve afbeelding van de maagwand, werden geen significante veranderingen waargenomen in netvlies bloedtoevoer, die aangeeft dat de bloed-systeem van de oogbol niet tijdens het modelleren geraakt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Foto’s van de oogzenuw retrobulbaire en de oogheelkundige slagader gelegen aan de meningeal schede, gevangen door middel van de chirurgische aanpak. Na het volledig verwijderen van de gerichte lengte van de oogzenuw, was de oogheelkundige slagader (pijlpunt) gelijktijdig met de meningeal omhulsel van de oogzenuw blootgesteld, en evenwijdig aan de oogzenuw. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Schematisch diagram van primaire en secundaire degeneratie locaties in de oogzenuw. Gedeeltelijke insnijding van de oogzenuw werd bereikt met behulp van het instrument zelf ontworpen chirurgisch assistent (pijlpunt). De axonen in direct beschadigde sites (dorsale snijden site van de oogzenuw in het transversale gedeelte in grijs) ondergaan primaire degeneratie, terwijl die in niet indirect beschadigde sites (Centraal en ventrale gebieden van de oogzenuw in het transversale gedeelte in het geel) secundaire degeneratie ondergaan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Operationele Procedure

Er zijn enkele punten waardig van aankondiging in het proces van modelbouw. In stap 4.2, moet de chirurgische beweging zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen beschadiging van de therapieën boven de subfascial spier. Vooral wanneer het snijden van de subcutane fascia in het buitenste laterale canthus, moet sharp-gekarteld verlostang worden gebruikt voor het trekken omhoog de subcutane fascia op het oppervlak van de fascia verticaal; de fascia moet worden gesneden met Vannas voorjaar schaar om te voorkomen dat schade aan de orbitale ader op de buitenste canthus, die in model mislukking door overmatig bloeden resulteren kan. 4.3 stap heeft het voordeel van potentieel voorkomen bloeden wanneer het direct verwijderen uit de bloedvaten. In het scheiden van de orbitale spieren in stap 4.5, de reden voor picken sharp-gekarteld pincet, maar niet Vannas is voorjaar schaar continu bloeden en de bloeding te voorkomen. De spieren zijn ronduit gescheiden aan beide zijden in de richting van de loodrecht op de huid fascia incisie; Ondertussen zijn de diepe spieren van de baan naar buiten en ook uitgerekt. Deze procedure zal onthullen diepere delen van de orbitale Holte, bieden een grotere chirurgische venster en onbelemmerde toegang tot weefsels bedekken de oogzenuw. In de bovenstaande procedures, als bloeden optreedt, druk moet worden uitgeoefend met behulp van steriele chirurgische of katoen swabs. Kleine bloeden stopt na enkele seconden door deze procedure. Het doel van stap 4.6 is om follow-up operaties te gemakkelijk verwijderen sommige vet en afzonderlijke spieren de baan spier kegel de oogzenuw in de richting van de oogzenuw in de orbitale diepte bloot te stellen.

De meest kritieke onderdelen van het huidige protocol zijn stappen 5.1-5.6. Het is belangrijk om niet te beschadigen de therapieën rond het hoofd van de oogzenuw. De oogzenuw moet gedeeltelijk worden verbeelde ten minste 1,5-2,0 mm vanaf de achterkant van het oog, om te voorkomen dat schade aan de oogheelkundige slagader dat doordringt de zenuw binnen 1 mm van het oog en levert bloed naar het innerlijke netvlies. Het doel van het snijden van de laterale rectus is te bereiken van betere blootstelling van de oogzenuw, zoals de laterale rectus breed is en uiteraard de weergave van de oogzenuw blokkeert. Ondertussen om te voorkomen dat het verwijderen van de oogheelkundige slagader die is gekoppeld aan de meningeal mantel (Figuur 5), is het noodzakelijk om te scheiden en distantiëren van de dura rond de oogzenuw en het vasculaire patroon van de meningeal schede, onderzoeken met behulp van pincet voorzichtig draaien de schede. Daarnaast moet een gebied verstoken van bloedvaten worden geïdentificeerd, waardoor een longitudinale knippen in de meningeal van de schede. Het is ook nodig om een kleine afstand van de achterkant van het oog, om te voorkomen dat het gedeelte van de dura dat is nauw verbonden met de oogheelkundige slagader. Het netvlies is meestal transparant en bloedvaten kan duidelijk worden afgebakend. In het geval van beschadigde retinale bloedtoevoer, is het netvlies verworden, wat leidt tot een melkwitte flocculator verschijning. Het glasvocht Kamer van het oog en de lens zal meestal bewolkt, met verminderde oog grootte worden na verloop van tijd. In deze studie bevestigde de preoperatieve en postoperatieve beelden van de fundus geen schade aan de maagwand bloedvoorziening in het objectmodel na het toepassen van de bovenstaande stappen.

Bovendien, speciale zorg is verplicht in verschillende stappen van dit model. Als u sharp-gebogen-gekarteld pincet of andere chirurgische instrumenten voor het blootstellen van de oogzenuw, moet de chirurg vermijden buitensporig geweld, als het kan schade aan de oogzenuw, de oogbol of de oogheelkundige slagader, wat resulteert in primaire letsel en netvlies ischemie. Daarnaast moet bloedvaten rond het oog niet worden beschadigd, voorkom aanhoudend bloeden, die zouden kunnen leiden tot de ondergang van de modellering. De SSAI gebruikt in dit experiment vereist gevoelige gebruik. Wanneer de oogzenuw wordt geplaatst binnen de instrument-groef, de oogzenuw en gegroefde oppervlak moeten strak worden uitgerust om te zorgen voor goede samenhang en herhaalbaarheid van elke diermodel. Met praktijk, kan de volledige chirurgische procedure worden voltooid binnen 15-20 minuten per oog, na de eerste post hebben bezuinigd is.

Wang et al. 19 publiceerde een soortgelijk diermodel van gedeeltelijke oogzenuw transect vastgesteld aan de hand van een kwantitatieve amputator van de oogzenuw. De chirurgische procedures omvat: 1) snijden elkaar de buitenste canthus, opschorting en tot vaststelling van de ooglidreflex superior; 2) verkennen van de oogzenuw, en transecting het superieure gedeelte van de oogzenuw met behulp van de amputator; en 3) wordt het bindvlies en de huid. Hoewel de chirurgische ingreep relatief eenvoudig was, zijn de volgende problemen ontstaan tijdens de operatie. Hoewel laterale canthus incisie kan bepaalde ruimte voor bewerking worden blootgesteld, was er een onvermijdelijk moet de oogbol voortdurend te rekken om bloot de retrobulbaire oogzenuw schede, vooral wanneer de chirurgen gewenst om een langere retrobulbaire bloot oogzenuw schede om verdere isolatie van de schede; de kracht voor het uitrekken van de oogbol was groter, dat is kans op letsel van de directe tractie van de oogbol en de oogzenuw. Geen speciale aandacht werd besteed aan bloedvaten die samen met de oogzenuw schede kan worden verminderd, en schade aan bloedvaten dreigt te leiden tot een ontbroken model vestiging. De belangrijkste procedures van secundaire schade model, als beschreven in dit document zijn: een nieuwe operatieve benaderen vanuit de laterale orbitale wand van de oogbol rechtstreekse toegang de retrobulbaire oogzenuw omringd door de orbitale spier kegel, vermijden van primaire schade aan de oogbol en oogzenuw, wanneer trekken naar beneden of naar de nasale laterale zijde van de oogbol. Deze nieuwe operationele aanpak verhoogt de ruimte van de chirurgische ingreep tijdens modellering en kunt gemakkelijk isolatie van de meningeal schede, die nauw verbonden met de oogheelkundige slagader, voor gedeeltelijke transect van de oogzenuw is. Gedeeltelijke oogzenuw transect werd uitgevoerd met een zelf ontworpen chirurgische instrument, dat kosteneffectieve en herbruikbare, vermindering van de totale kosten van de modellering. De rat orbitale structuur is anders dan die van andere zoogdieren, met de baan die het dichtst bij de canthus en geen botstructuur, maar bedekt met spieren. De chirurgische benadering kan oplopen tot het achterste gedeelte van de oogbol zonder de behoefte aan het vernietigen van de orbitale bot en beenvlies. Door middel van strikte preoperatieve desinfectie en postoperatieve antibiotische profylaxe, infectie, ontsteking en oedeem sterk teruggebracht.

Zelf ontworpen chirurgisch assistent Instrument

Het model van de rat van gedeeltelijke oogzenuw transect werd opgericht met behulp van het instrument zelf ontworpen chirurgisch assistent, wiens belangrijkste kenmerken als volgt zijn. Het kan helpen in gedeeltelijke kwantitatieve transect van de oogzenuw blootgesteld aan de gegroefde rand, ook transect consistentie tussen de verschillende dieren. We getest en gecontroleerd de herhaalbaarheid van model vestiging met SSAI. De maximale variatiecoëfficiënt was 1,85%, met een gemiddelde waarde 0,67% ±0. 44%. 20 deze resultaten wijzen erop dat de SSAI kan worden gebruikt om gedeeltelijke oogzenuw transect modellen, met bevredigende reproduceerbaarheid en VNiformity.

De gegroefde oppervlak breedte en het ontwerp van de halve cirkel van de binnenzijde van de groef kunnen een meer vaste effect hebben op de oogzenuw en maken de gegroefde oppervlak en oogzenuw hechten meer strak, experimentele fouten en bijwerkingen ook te verlagen. De gegroefde rand biedt een betere bescherming van de oogzenuw in de groef tijdens de operatie, die geen schade aan de oogzenuw in de groef, ongeacht van de cutter scherpte toebrengen zal. Een ander voordeel van de gegroefde rand is crush letselpreventie tijdens oogzenuw transect.

Het is dienstig voor de exploitatie in de diepe en smalle ruimte. Hoewel de nieuwe operationele aanpak is uitgebreid, het traject blijft diep, en de gezamenlijke sectie en hand-held paal kunnen worden gebruikt om de gegroefde kop gemakkelijk onder de mantel van de oogzenuw follow-up bewerkingen uit te voeren. Wanneer het instrument wordt gebruikt voor bewerking, kan een breed scala van scharen voor transect, bijvoorbeeld een tip 26 G naald worden gebruikt. Zelfs een saffier chirurgische sonde mes kan worden geselecteerd om te voorkomen kneuzingen en crush letsel, veroorzaakt door de schaar. Groove oppervlakken kunnen worden gemaakt in verschillende verticale diepten te voltooien van variërende graden van oogzenuw snijden.

In vergelijking met de amputator van Wang heeft et al. de SSAI een eenvoudiger structuur. Bovendien, is de stap van het snijden handiger met behulp van de SSAI, met verbeterde consistentie en herhaalbaarheid van de diermodel. Het scala van instrumenten die van toepassing zijn voor het snijden met de SSAI is ten slotte ook breder. Kortom, kan SSAI, waardoor kwantitatieve en uniforme insnijdingen van de zenuw, dienen als een effectief instrument voor de vaststelling van rat modellen voor de beoordeling van de oogzenuw transect.

Kenmerken van de Rat gedeeltelijke oogzenuw transect Model

De gedeeltelijke oogzenuw transect model is handig voor de beoordeling van secundaire degeneratie in RGCs. De potentiële verdienste van dit model is de mogelijkheid om te scheiden van secundaire degeneratie primaire nauwkeurig in situ, zowel in de oogzenuw en retina. De centrale en ventrale optische zenuwen waren meer vatbaar voor secundaire schade na gedeeltelijke transect (ongeveer 1/3 tot 1/2) van de dorsale oogzenuw (Figuur 6). In het netvlies, moet de regionale locatie van primaire en secundaire letsels van RGCs berusten op de topografie van de oogzenuw overeenkomt met retinale RGCs na gedeeltelijke transect. Als het hele netvlies van de rat is onderverdeeld in de dorsale (superior) en ventrale (inferieure) delen, zijn secundaire en primaire verwondingen aanwezig in beide delen. Echter, op basis van de relatie tussen RGCs op het netvlies en de oogzenuw axon, dood van de regering van Cambodja in het ventrale netvlies moet worden vooral toegeschreven aan secundaire schade (Figuur 3). 12 , 22 , 23 de voordelen van dit model zijn: eenvoudig en gemakkelijk te bedienen instrument met standaardprocedures; geen effect op de oogheelkundige vaartuigen; goede reproduceerbaarheid en stabiliteit. Deze techniek kan worden gebruikt om te transfect van RGCs van deze ruimtebesparende operatieve benadering door korte storende RNAs (siRNAs), plasmiden, toe te passen en virale vectoren aan de gedeeltelijke oogzenuw stomp; Daarnaast kon reagentia worden geplaatst op de gedeeltelijke oogzenuw stomp voor de selectieve verwerking of etikettering van RGCs.

Algemene, primaire en secundaire letsels van RGCs naast elkaar na gedeeltelijke oogzenuw transect in deze diermodel, met een duidelijke grens in het netvlies tussen de twee letsel types. Hoewel de vereniging van oogzenuw axonen en locatie van de regering van Cambodja op het netvlies verder onderzoek voor een nauwkeuriger onderscheid moet, deze ruimtebesparende operatieve benadering vergroot het bereik van de toepassing van het model en kunnen onderzoekers om te verkennen de mechanismen van secundaire schade in RGCs in een nieuwe manier.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de Beijing Natural Science Foundation (7152038), de fundamentele middelen voor onderzoek voor de centrale universiteiten van centrale Zuid-Universiteit (2016zzts162) en de Science Research Foundation van Aier Eye ziekenhuis Group (Grant nr. AF156D11). Tot slot bedankt Fancheng Yan Yiping Xu voor de onschatbare steun door de jaren heen.

Materials

Animal Aneathesia Ventilator System MIDMARK Matrx VMR
Isoflurane RWD Life Science Co. R510-22
Surgical Microscope Leica AG, Heerbrugg, Switzerland M620 F20
Tobramycin Eye ointment Alcon H20110312
Fluorogold Biotium 80014
Iris scissors 66vision Co. 54026
Vannas spring scissor 66vision Co. 54137B
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps  66vision Co. 53329A
Sharp-curved forceps 66vision Co. 53324A
Sapphire surgical probe 66vision Co. 50205TA
26G needle tip Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. 3151474
10 μl Hamilton Syringe Hamilton Co. 80030
5-0 non-absorbable suture Johnson & Johnson International Co. W580
Chlorhexidine Sigma-Aldrich 282227
Stereotaxie apparatus RWD Life Science Co. 68026
Retinal Imaging System OptoProbe Ltd. OPTO-RIS
RetCamII wide field imaging system Clarity Medical Systems,Inc. RetCamII
Fluorescence microscope Leica Microsystems Inc. DM6000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
  2. Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
  3. Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
  4. Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
  5. Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
  6. Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
  7. Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
  8. Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
  9. Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
  10. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  11. Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma–mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
  12. Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
  13. Magharious, M. M., D’Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
  14. Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
  15. Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
  16. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  17. Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
  18. Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
  19. Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360 (2012).
  20. Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
  21. Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
  22. Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
  23. Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881 (2013).

Tags

Partial Optic Nerve TransectionSecondary DegenerationRetinal Ganglion CellsGlaucomaNovel Surgical ApproachSpace-saving TechniqueOptic Nerve StabilizationPrimary And Secondary Injury

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yan, F., Guo, S., Chai, Y., Zhang, L., Liu, K., Lu, Q., Wang, N., Li, S. Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (128), e56272, doi:10.3791/56272 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image