İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama
Summary
Endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) kitle spektrometrik analizi için bir yöntem sunulur. Moleküler ağırlık kesme filtrasyon, Kromatografik ön ayırma, kitle spektrometrik analizi ve peptid kimlik stratejileri sonraki bir arada istihdam ederek, yaklaşık on göre bilinen CSF peptidome genişletmek olası Önceki çalışmalar için.
Abstract
Bu iletişim kuralı endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) tanımlamak için geliştirilmiş bir yöntem açıklanır. Bu amaçla daha önce gelişmiş bir yöntem molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon üzerinde temel ve kitle spektrometrik analizi bir çevrimdışı yüksek pH ters faz HPLC ön ayırma adım ile kombine edildi.
Salgı içine CSF merkezi sinir sistemi hücreleri tarafından döken molekülleri kaldırılması için ana yoludur. Böylece, merkezi sinir sistemi birçok süreçlerinde değerli bir tanı sıvı işleme bos yansıtılır. CSF 8-9 büyüklük konsantrasyon aralığı span protein içeren karmaşık bir kompozisyon vardır. Proteinler yanı sıra, önceki çalışmalarda de çok sayıda endojen peptidler varlığını göstermiştir. Daha az yoğun protein okudu, bunlar da potansiyel ilgi biyolojik basılı tutarak.
Endojen peptidler MWCO filtrasyon yoluyla CSF protein içeriğinden ayrı kaldık. Protein içeriği çoğunluğu örnekten kaldırarak, okudu numune hacmi ve böylece aynı zamanda endojen peptidler toplam miktarını artırmak mümkündür. Filtrated peptid karışımı karmaşıklığı ters faz (RP) HPLC ön ayırma adım alkali pH önce LC-MS analizi de dahil olmak üzere tarafından ele alındı. Ayırma kombine edildi nerede 60 kesirler 12 havuzlu bir basit birleştirme düzeni ile analiz zaman tüketimi böylece hala büyük ölçüde ortak elüsyon kaçınarak azaltılabilir.
Otomatik peptid kimlik üç farklı peptit/protein kimlik yazılım programları kullanarak ve daha sonra sonuçları birleştirerek gerçekleştirildi. Farklı programlar tamamlayıcı yerine üç arasında üst üste tanımlamaları % 15’den az ile karşılaştırılabilir.
Introduction
Biyolojik beyin-omurilik sıvısı (bos) içinde şu anda nörodejeneratif hastalıklar araştırma dönüştürme. Alzheimer hastalığı içinde 60 milyon etkileyen en sık görülen nörodejeneratif bozukluğu, insanlar dünya çapında1,2, amiloid beta peptid, protein tau, Mikrotubul sabitleme oluşan bir biyomarker üçlüsü ve bir fosforile tau formu, hastalık yüksek duyarlılık ve özgüllük ile algılayabilir ve tanılama araştırma ölçütünü3‘ e eklenmiştir. Parkinson hastalığı ve Multipl skleroz, gibi diğer nörodejeneratif hastalıklarda proteomik çalışmalar bazıları şu anda klinik çalışmalar4,5 değerlendirilmesinde altında olan çok sayıda biyomarker adayları belirledik ,6.
Proteinler, CSF endojen peptidler7,8,9,10,11,12bolluğu da içerir. Bölünme ürünleri birçok beyin kaynaklı proteinlerin oluşturan, Bu peptidler de potansiyel olarak önemli hastalık biyolojik bir kaynağı gösterir. İnsan CSF içinde tanımlanan endojen peptidler stok artırmak ve CSF endopeptidomic analizleri klinik çalışmalarda etkinleştirmek için bir yöntem numune hazırlama LC-MS analizi (kısa protokol düzeni şekil 1 ‘ de dahil edilmiştir için geliştirilmiş ). Yeni yapılan bir çalışmada Bu yöntemde uygulama neredeyse 16400 endojen CSF peptidler havuza alınan CSF örneklerinde belirsiz tanı, birkaç bireylerin bilinen CSF endopeptidome panolarında13genişleyen tanımlaması içinde sonuçlandı. Yöntemi, isteğe bağlı olarak miktar için izobarik etiketleme yaklaşımı ile birlikte kullanılabilir.
Numune hazırlama
Plazma bileşenlerinin (albümin ve immünglobulin) ana kaynağıdır protein seviye CSF, üzerinde kan beyin bariyerini14,15geçen. Onların yüksek bereket düşük bol, beyin kaynaklı örnek bileşenleri tespiti engellemektedir. Endojen peptidler, böylece önemli ölçüde daha büyük bir hacim böylece alt-bol peptidler olarak algılanmasını sağlayan LC-MS çözümleme için kullanılacak CSF peptid ekstresinin izin veren yüksek bol proteinler üzerinden kolayca ayrılabilir.
Burada sunulan iletişim kuralında, molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon CSF peptidler protein fraksiyonu ayırmak için kullanılan; önceki birkaç içinde kullanılan bir yöntem8,9,10,11,12,16çalışmalar. Filtrasyon adım yüksek pH mobil faz degrade gerçekleştirilen çevrimdışı bir RP HPLC ön ayırma adım izledi. Ana ayrım varlık pH ile tandem, iki RP HPLC adımları uygulayarak, iki adım arasında seçicilik farkı esas olarak değiştirilmiş peptid saklama sonucu olarak farklı peptid şarj Birleşik kaynaklanır. Yüksek pH peptid ön ayırma LC-MS önce asidik şartlar altında uygulanması peptid kimlik17,18artan ve hatta bu amaç için karmaşık biyolojik üstün olmak için etkili kanıtlamıştır örnekleri daha fazla dik ayırma modu19, güçlü kedi-iyon değiştirme (SCX) ve RP20gibi göre. Analiz süresini kısaltmak için bir birleştirme düzeni, hangi hala büyük ölçüde peptidler farklı ortak elüsyon kaçınılması RP HPLC yüksek çözme gücü nedeniyle her 12inci kesir (örneğin, kesirler 1, 13, 25, 37 ve 49), biriktirmenin kullanılıp yapıldı. kesirler LC-MS20,21adım.
Peptid tanımlama
Peptid kimlik peptidomic çalışmalarda proteomik çalışmaların bundan hiçbir enzim bölünme veritabanı aramada belirtilen ve sonuç olarak, kimlik oranları genellikle daha düşük11farklıdır. Bir son çalışmada13 adaptif puanlama kullanarak varsayılan algoritma ilgili yazılım programının puanlama değiştirildiğinde endojen peptidler Sequest ve maskotu ile elde edilen kimlik oranları önemli ölçüde geliştirilmiş gösterdi algoritma süzücü, endojen peptidler için en iyi skor algoritmaları, tryptic peptidler13farklı gösteren. Çalışma, tepeler (BSI) yazılımını kullanarak otomatik peptid de novo üzerinde dayandırılmış kimlik iki parça iyon parmak izi tabanlı arama motorları için tamamlayıcı bulundu ki, önemli ölçüde daha büyük kümesi içinde bir sonucu tespit peptidler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir yüksek-pH RP HPLC ön ayırma adım endojen peptidler kurtarılması için daha önce gelişmiş bir iletişim kuralı için moleküler ağırlık Ultrafiltrasyon11 tarafından getirilmesi göreli örnek karmaşıklığı azaltmak ve böylece bir 5-fold daha büyük için izin belirlenmesi için numune hacmi. Bu, sırayla, peptidler her kesir mevcut alt kümesini konsantrasyonu artar ve böylece düşük bol peptidler algılama olasılığını geliştirilmiş.
Bir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çok zeki önder Batth ve meslektaşları kadar ön ayırma yöntemini ayarlama tavsiye için teşekkürler.
Bu eser İsveçli Araştırma Konseyi, Wallström ve Sjöblom Vakfı, silah ve Bertil Stohne Vakfı Stiftelse, Magnus Bergwall Vakfı, Åhlén Vakfı, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för finansman tarafından desteklenen Gamla Tjänarinnor, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Frimurarestiftelsen ve FoU-Västra Götalandsregionen.
Bu proje için finansman Ana alıcılar Kaj Blennow, Henrik Zetterberg ve Johan Gobom vardı.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
