AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão¹ ou vídeo microscopia de força² permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser³, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas⁴ ou na vivo ⁵ ou nanopartículas microrheology⁶ permitem a antecipação de um tecido propriedades mecânicas e respostas.

AFM é uma técnica topográfica tridimensional com resolução de rugosidade da superfície e conformidade da deflexão de dicas do cantilever em caso de contacto com uma superfície sondado⁷de alta resolução atômica. Diferentes metodologias empregando AFM foram desenvolvidas para investigar as propriedades da superfície, incluindo medição de atrito, forças de adesão e nas propriedades viscoelásticas de diversos materiais. Recentemente, a AFM tem emergido como uma ferramenta poderosa para recuperar informações sobre as propriedades mecânicas de amostras biológicas. Em particular, AFM não invasiva pode extrair o módulo de cisalhamento complexo de células únicas aplicando recuos oscilatórios com uma ponta de micro ligada a um cantilever de constante flexão conhecido⁸. Isto permite-nos inferir a resultante de forças. No entanto, AFM não é exclusiva e diferentes metodologias permitem extrair dados reológicos e propriedades mecânicas de células individuais (por exemplo, micropipeta aspiração⁹, magnético de torção cytometry (MTC)¹⁰, ou uniaxial elástica testando a¹¹).

No entanto, a aplicação dessas novas metodologias para processos complexos morfogenéticas não é simples. Os principais desafios enfrentados na determinação das propriedades mecânicas dos tecidos embrionários são os pequenos (µm a mm), macio (no 10² – 10 intervalo de⁴ Pa) e natureza de visco-elástico (dando origem a fenómenos de tempo-dependente) do material¹². Portanto, é importante adaptar os métodos utilizados para a determinação das propriedades mecânicas (rigidez, viscosidade, aderência) para o caso específico de embriões e organismos em desenvolvimento. Duas questões importantes devem ser tomadas em consideração quando analisando reológicas abordagens para estudar o desenvolvimento: para evitar interferência intrusiva e para fornecer fácil acessibilidade. Neste cenário, aspiração micropipeta, MTC e teste de tração apresentam limitações. No primeiro caso, a alta deformação que sofre de uma célula pode alterar suas propriedades fisiológicas e mecânicas⁹. No segundo caso, a necessidade de aderir firmemente o tecido experimental a um substrato para garantir que as tensões aplicadas deformam o citoesqueleto localmente também poderia apresentar efeitos no estado de ativação das células e, consequentemente, em suas características mecânicas¹⁰ . Abordagens de tração uniaxiais, últimas são limitadas pela geometria do desenvolvimento de organismos e acessibilidade¹¹.

AFM parece ser mais adequado para o estudo de processos de desenvolvimento, pois permite o estudo de amostras biológicas diretamente em seu ambiente natural sem qualquer preparação da amostra pesada. Além disso, como a dissociação dos tecidos embrionários é geralmente difícil, o tamanho reduzido das sondas AFM fornece um alto grau de versatilidade com nenhuma limitação na escolha do tipo de meio (aquoso ou aquosos), temperatura da amostra ou produto químico composição da amostra. AFM é versátil o suficiente para ser aplicado a grandes domínios e escalas de tempo e tem sido empregada para recuperar propriedades materiais de tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento ou em condições fisiológicas. Todo nativos tecidos tais como artérias¹³ ou ossos¹⁴ foram estudadas do ponto de vista topográfico e em alguns casos, como a esclera, propriedades mecânicas também foram recuperados¹⁵. Topografia também tem sido explorada em embriões ao vivo, permitindo a visualização de, por exemplo, o rearranjo de célula durante a morfogênese em Xenopus¹⁶. Protocolos de preparação abrangente, última amostra foram desenvolvidos para determinar parâmetros mecânicos durante os processos de desenvolvimento diferentes. Nanoindentação mapas foram gerados em secções de tecido unfixed nativo para o filhote embrionário do aparelho digestivo,¹¹; propriedades adesivas e mecânicas obtida para células individuais ectoderme, mesoderme e endoderme progenitoras isoladas de gastrulating zebrafish⁴embriões; realizadas medidas de rigidez para o epiblasto e raia primitiva em explantes de embriões aviários¹⁷; e um padrão distinto de gradientes de rigidez definidos diretamente no cérebro embrionário do Xenopus⁵.

Um salto qualitativo significativo para a aplicação de AFM para explorar o desenvolvimento embrionário pode vir de aproximação simples processos morfogenéticas acessíveis. Zebrafish epiboly é um evento essencial e conservado, em que diferentes tecidos coordenam em um espaço restrito esférico para direcionar a expansão da Drosophila em poucas horas. No início da epiboly zebrafish (fase esférica), uma camada superficial de células, a camada envolvente (EVL), abrange um boné semi-esférico de blastómeros centrada no polo animal do embrião sentado em uma cela sincicial gema maciça. Epiboly consiste a expansão cortical ala vegetal do EVL, as células profundas (DCs) da Drosophila e a camada externa da célula em torno da gema gema sincicial (E-YSL). Epiboly termina com o encerramento do EVL e as DCs no polo vegetal^18,19,20. Como e onde as forças são geradas durante a epiboly e como eles são acoplados globalmente ainda não está claro^1,21.

Aqui descrevemos detalhadamente como aplicar AFM para inferir Propriedades tecido mecânico passivo durante progressão epiboly a gema de zebrafish celular na vivo. Para isso, usamos pequenas microesferas anexadas a AFM cantilevers como sondas. Isto permite a recuperação de informações locais precisas dentro da superfície de células não-uniforme de gema e estudar gradientes tensionais e sua dinâmica ao longo do tempo. AFM alternativo aproxima-se como aqueles que usam Cunha cantilevers²², will não processar dados local que é suficientemente precisos. A técnica de cunha, que requer habilidades de manipulação muito cuidado para colar um pedaço maior do que o tamanho da amostra no final do cantilever, não é adequada para sondar o embrião (~ 2 dobras maiores que o comprimento do cantilever) mecânica.

Modelagem e caracterizar as propriedades viscoelásticas de células de forma qualitativa e quantitativa permitem uma melhor compreensão da sua biomecânica. Do ponto de vista biomecânico, é essencial para compreender a epiboly e não apenas a demanda conhecimento em medições de tensão cortical e dinâmica, que pode ser extraída por AFM; assim, não há necessidade de informações sobre as propriedades biofísicas do tecido. Para extrair essas informações, uma variedade de técnicas de reologia celular foram desenvolvidos ao longo dos anos para caracterizar os diferentes tipos de células sob diferentes condições fisiológicas²³. Eles incluem AFM, MTC e pinças ópticas (OT). Esses métodos, no entanto, têm provados inadequados para mesoscópica análises na escala de embriões ou órgãos. Como alternativa, adaptámos com êxito acompanhamento de nanopartículas microrheology⁶ para medições reológicas na vivo . Esta técnica analisa os deslocamentos browniano das partículas isoladas e infere Propriedades micromecânicas local.

Junto microrheology AFM e nanopartículas permite a definição de dinâmica tensional cortical e propriedades mecânicas internas da gema durante epiboly. Esta informação apoia plenamente um modelo no qual anisotrópica stress desenvolve-se em consequência as diferenças na resposta de deformação do EVL e a camada citoplasmática de gema (YCL) para a contração isotrópica actomyosin do córtex E YSL é essencial para o movimento líquido direcional da EVL e epiboly progressão¹.