Применение методики многоцветной FlpOut для изучения морфологии одноклеточного высокого разрешения и взаимодействия клеток глии в дрозофилы
Summary
Клетки отображать различные морфологии и установить различные взаимодействия со своими соседями. Этот протокол описывает раскрыть морфология одиночных клеток и исследовать взаимодействия ячеек с помощью хорошо отлаженная система Gal4/Уан выражение.
Abstract
В ячейках отображаются различные морфологии и сложные анатомические взаимоотношения. Как клетки взаимодействуют с их соседями? Отличаются ли взаимодействие между типами клетки или даже в пределах данного типа? Какие виды пространственных правил они следуют? Ответы на такие фундаментальные вопросы в vivo пока сдерживаются отсутствием инструментов для маркировки одноклеточного высокого разрешения. Здесь приводится подробный протокол для одиночных клеток с техникой многоцветной FlpOut (MCFO). Этот метод опирается на три по-разному тегами Репортеры (HA, флаг и V5) под контролем UAS которые хранятся немого transcriptional Терминатор, окруженный двумя FRT мест (FRT-стоп FRT). Ударный импульс тепла Индуцирует экспрессию теплового шока индуцированной ФЛП рекомбиназа, который случайно удаляет FRT-стоп FRT кассеты в отдельных клетках: выражение происходит только в клетках, которые также express драйвер GAL4. Это приводит к массив по-разному окрашенных клеток типа ячейки, который позволяет визуализировать морфологии отдельных клеток с высоким разрешением. Например метод MCFO может сочетаться с драйверам глиальных GAL4 для визуализации морфологии различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы .
Introduction
Глии, население не нейрональных клеток нервной системы (NS), давно считается статическим основу для нейронов и поэтому не были изучены в деталях. Однако в организме человека, глии составляют подавляющее большинство клеток в NS (~ 90%) и делятся на несколько различных категорий, в том числе астроциты, олигодендроциты, Микроглия и Шванновские клетки. У дрозофилыглии составляют около 10% ячеек в NS. Интригующе их морфологии и функции удивительно похожи на те, нашли в позвоночных1,2. Их морфологии включают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) формирование эпителия, ensheathing и экзоцитоз подобных клеток.
Дрозофилы центральной нервной системы (ЦНС) состоит из следующих основных структур: области коры, которые содержат нейрональных клеток органов; neuropils, что гавань синаптических связей; аксон малые и большие участки, которые соединяют разные neuropiles; периферических нервов, которые связывают органы чувств и мышцы с ЦНС (рис. 1). Глии находятся связанные с все эти анатомические структуры: глии (CG) коры в кортикальной регионах, экзоцитоз как ГЛИА (ALG) и глии (EG) ensheathing в neuropile регионах, глии ensheathing также связаны с Центральной аксона участки и периферической нервы (EGN) и, наконец, два листа, как ГЛИА, perineurial глии (PG) и subperineurial (SPG), которые вместе образуют непрерывный слой, который охватывает весь NS (рис. 2).
Предыдущие исследования показали, что глии играют важную роль в развитии НС; они контролировать число нейрональных клеток, реагируя на системно циркулирующих инсулин как пептиды, трофических оказывать нейронов, например экзоцитоз нейрон лактат шаттл и ликвидации умирающего нейронов фагоцитоза3,4 , 5 , 6. в зрелых NS, глии поддерживать BBB, занимают нейротрансмиттеров и поддержания ионного гомеостаза, выступать в качестве основных иммунные клетки в НС, так как макрофаги не может нарушать BBB и модулировать синаптической активности, а также поведение животных6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Ли различные подтипы глиальных выполняют специализированные функции, важный вопрос остается открытым. Однако систематический анализ генома общесистемной глии, особенно в взрослых, была затруднена отсутствием соответствующих генетических инструментов для их обработки. Здесь представлен метод, который позволяет легко и эффективно характеристика форм клеток для изучения взаимодействия сложных ячеек. Этот метод был применен к характеризуют морфология различные подтипы глиальных в мозге взрослого дрозофилы , но, в зависимости от конкретного драйвера GAL4 используются, могут быть адаптированы для изучения нейронов12,13 , каких-либо смешения клеток и в принципе любой ткани в любой стадии развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает простой и эффективный метод для изучения морфологии различных типов клеток в ткани интерес с высоким разрешением. С MCFO техникой несколько репортеров с различных эпитопов Теги используются в сочетании для многоцветного стохастических маркировки (ри…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Арним Jenett, Aljoscha Нёрн и другие члены Рубин лаборатории для консультаций и совместное использование неопубликованных реагентов и Janelia летать свет команде проекта для создания конфокальный изображений. Авторы также поблагодарить членов в Галлии лаборатории для комментариев на рукопись.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
