Summary

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Published: October 20, 2017
doi:

Summary

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Abstract

Las células muestran morfologías diferentes y complejas relaciones anatómicas. ¿Cómo las células interactúan con sus vecinos? ¿Las interacciones difieren entre los tipos de la célula o incluso dentro de un tipo determinado? ¿Qué tipo de reglas espaciales siguen? Las respuestas a tales preguntas fundamentales en vivo se han visto obstaculizadas hasta ahora por la falta de herramientas para el etiquetado de celda única de alta resolución. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para apuntar las células con una técnica de FlpOut (MCFO MultiColor). Este método se basa en tres diferente etiquetados Reporteros (HA, bandera y V5) bajo control de la UAS que se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor induce la expresión de un calor inducida por choque Flp recombinase, que elimina al azar los cassettes FRT-parada-FRT en celdas individuales: expresión ocurre solamente en células que expresan también un conductor de GAL4. Esto conduce a una matriz de células diferentemente coloreadas de un tipo celular dado que permite la visualización de la morfología de la célula individual en alta resolución. Por ejemplo, la técnica MCFO puede combinarse con controladores específicos de GAL4 gliales para visualizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila .

Introduction

Glia, la población de células no neuronales del sistema nervioso (NS), se ha creído durante mucho tiempo para proporcionar un marco estático para las neuronas y por lo tanto no fueron estudiados en detalle. Sin embargo, en los seres humanos, glía constituyen la gran mayoría de las células en el NS (~ 90%) y caída en varias categorías diferentes, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células de Schwann. En Drosophila, glía constituyen cerca del 10% de las células en el NS. Curiosamente, sus morfologías y funciones son notablemente similares a las que se encuentran en vertebrados1,2. Sus morfologías incluyen barrera blood – brain (BBB) formación de epitelios, envolvente y astrositos-como las células.

El sistema de nervioso central de Drosophila (CNS) consta de las siguientes estructuras principales: regiones de la corteza que contienen los cuerpos celulares neuronales; neuropils que albergan conexiones sinápticas; tractos de axones pequeños y grandes que conectan diferentes neuropiles; nervios periféricos que conectan músculos y órganos sensoriales con el SNC (figura 1). Glia se encuentran asociados a todas estas estructuras anatómicas: glía (CG) de la corteza en las regiones corticales, astrositos-como glia (ALG) y glía envolvente (GE) en las regiones de neuropilos, glia envolvente también están asociados con tractos axón central y periférico nervios (EGN) y por último, dos de hoja-como glia, glia perineurial (PG) y subperineurial (SPG), que juntos forman una capa contigua que cubre el entero NS (figura 2).

Estudios anteriores han demostrado que glía desempeñan un papel importante en el desarrollo del NS; monitorear el número de células neuronales reaccionando a la circulación sistémica péptidos similares a la insulina, proporcionan apoyo trófico para las neuronas, como la lanzadera de lactato astrositos-neurona y eliminar las neuronas moribundas por fagocitosis3,4 , 5 , 6. en el NS maduro, glia mantener el BBB, tomar neurotransmisores y mantener la homeostasis iónica, actúan como las principales células inmunes en el NS, puesto que los macrófagos no incumple el BBB y modulan la actividad sináptica así como el comportamiento de los animales6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

Si los diferentes subtipos gliales realizan funciones especializadas, sigue siendo una incógnita importante. Sin embargo, un análisis sistemático del genoma de glia, especialmente en el adulto, se ha visto obstaculizado por la falta de adecuadas herramientas genéticas para su manipulación. Aquí, se presenta un método que permite la caracterización eficiente y fácil de las formas de la célula para el estudio de las interacciones célula-célula compleja. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila , pero, según el driver específico de GAL4 utilizado, podría adaptarse para estudiar las neuronas12,13 , cualquier tipo de entrelazar las células y en principio cualquier tejido en cualquier fase del desarrollo.

Protocol

1. preparación de moscas para los experimentos de FlpOut MultiColor (MCFO) Nota: técnica MCFO el se refiere a una versión modificada de la supresión de casete parada mediada por Flp llamada (FlpOut). Moscas transgénicas de MCFO llevan un promotor de choque térmico (hsp)-Flp recombinase y diferentes reporteros en UAS de control. Cada reportero consiste en un esqueleto común de myristoylated (myr) super carpeta verde fluorescente en una proteína (sfGFP), que 10 copias de una etiqueta del…

Representative Results

Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse mediante la técnica MCFO en el cerebro adulto de Drosophila . La figura 3 muestra un esquema del método. Tres diferentemente etiquetadas de membrana Reporteros (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG y myr-smGFP-V5) bajo control de la UAS se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor…

Discussion

Este protocolo describe un método sencillo y eficaz para estudiar la morfología de los diferentes tipos de células en un tejido de interés en alta resolución. Con la técnica MCFO, varios reporteros con epítopos diferentes etiquetas se utilizan en combinación para etiquetado estocástico multicolor (figura 2). Similar a otros métodos como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta la diversidad d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Arnim Jenett Aljoscha Nern y otros miembros del laboratorio Rubin de asesoramiento e intercambio de reactivos no publicados y el Janelia volar luz equipo de proyecto para la generación de imágenes confocales. Los autores también agradecen a los miembros del laboratorio galo de comentarios sobre el manuscrito.

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

References

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Cite This Article
Batelli, S., Kremer, M., Jung, C., Gaul, U. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila. J. Vis. Exp. (128), e56177, doi:10.3791/56177 (2017).

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