压电高精度手术骨切除 (相量): 改进小鼠颅骨窗手术的技术
Summary
压电手术已导致改善人颌面部和牙科手术。我们已经制定了一个优化压电手术的小鼠颅窗手术的协议。
Abstract
光子显微镜已广泛应用于成像神经元体内。反复成像需要植入颅骨窗口或反复细化颅骨。颅窗手术通常是用高速旋转钻头进行的, 许多调查人员发现它具有挑战性, 以防止钻头损坏细腻的硬脑膜和血管。需要进行广泛的训练和练习, 以去除骨骼而不损伤底层组织, 从而使颅骨窗手术困难, 耗时, 并产生组织损伤。压电外科, 广泛用于颌面和牙科手术, 利用超声振动去除骨不损伤软组织。我们开发了一种应用压电手术改善小鼠颅骨窗手术的方法, 用于制备光子成像。在我们的实验室比较发现, 该方法需要较少的手术时间, 并有较低的平均率的硬脑膜出血比颅窗手术与旋转钻机。
Introduction
颅窗手术制备啮齿动物为光子成像在体内已成为神经科学的一项重要技术。骨的去除或细化是必要的, 以准备的小鼠光学成像与光子显微镜。通过完全移除骨骼区域以暴露基础硬脑膜1, 或者通过将骨骼区域细化而不完全从硬脑膜2中取出来执行此手术。薄头骨方法可能产生较少的炎症和小胶质细胞的激活3 , 但提供了一个较浅的深度的成像, 一个较小的成像窗口大小 (200 µm) 和有限的时间段期间, 该窗口可以成像由于骨骼再生2.添加一个抛光和增强玻璃窗口 (端口) 可以增加成像的大小和成像周期, 但很难执行4。
目前的两种手术都使用高速旋转钻头来瘦身或从头骨中取出骨头。薄头骨技术还使用手术刀后, 进一步瘦骨2。端口技术要求用砂砾4进行高速抛光的额外步骤。在高速旋转钻头中, 空气动力涡轮或电动机使钻头在高速旋转。作为旋转钻头的骨骼和软组织, 有破坏硬脑膜和下血管的危险。手术的成功取决于外科医生的技能。除了这些用机械手术方法准备的窗户外, 还开发了一种用不同溶液光学清除头骨的化学方法5,6。然而, 由于压电手术是一种机械的手术方法, 我们在这里的比较将限于其他机械方法。
压电手术装置利用超声振动分解矿化骨而不损害底层软组织, 从而为快速瘦大面积骨提供了一种方法。在压电外科手机中, 涡轮被一堆陶瓷圆盘所取代, 当电流被应用时, 圆盘在超声波频率下振动。振动通过手机转移到金刚石涂层尖端, 通过骨骼切开, 而不会损伤软组织, 这比不区分组织类型的旋转钻头的优势。压电手术最初是为人类使用的托马斯 Vercellotti, 并导致改善牙科和颅 maxilofacial 手术7,8,9,10,11.
压电手术已被用于制造大鼠截骨术, 并被磁共振成像 (MRI) 和组织学发现比传统的牙科钻具明显减少12。作者认为, 压电手术是安全的, 以消除骨近软脑组织。然而, 老鼠有一个更薄的硬脑膜, 更容易受损, 这项研究并没有为慢性光学成像准备窗户。慢性影像学要求血管不受损, 而血液凝块不在窗口下形成。对硬脑膜的损伤导致炎症, 导致窗口云, 激活小胶质细胞和活性星形胶质的增殖。在这里, 我们有优化的压电手术小鼠, 以创建瘦头骨和完整的骨清除颅窗适合慢性成像。我们将这项手术技术与高速旋转钻机制备的颅骨窗手术进行了比较。
Protocol
Representative Results
Discussion
手术可以通过改变手术技巧来修改。有许多不同大小的小费, 可以应用到手机。更改笔尖的大小或形状将导致不同大小的窗口。除了4毫米的尖端, 我们还尝试了3毫米的尖端, 并发现它也工作良好。即使与冰冷 ACSF 的灌溉, 我们无法得到良好的结果, 因为过于狭窄 (约0.25 毫米) 的提示, 由于集中振动造成太多的热量和燃烧的骨骼导致损害的基础硬脑膜。我们还没有尝试过许多其他可用的提示, 我们预计其他实验室可能会找到新的应用程序, 为这些不同的提示。虽然手术相对简单, 但我们发现有几个步骤可能需要进行故障排除。第一个是, 振动尖端产生了大量的湍流在 ACSF, 这减少能见度, 并产生困难, 确定骨深度在骨细化步骤的手术。我们建议, 如果很难看到骨头有多薄, 休息一下, 用不育的棉签涂抹在骨头的一侧, 使头骨和窗户干燥。不要将棉签直接涂抹在窗户上, 因为粗糙的表面会损害到薄骨。检查深度后, 重新应用 ACSF 并继续手术。我们还发现, 如果硬脑膜受损, 通常是由于外科医生给小费施加了太多的压力。更轻柔地握住手机, 施加更少的力就有可能解决这个问题。如果外科医生用力刮骨上的尖端, 它会导致在薄骨骨折, 并损害头骨。最后, 如果在瘦骨后, 底层的硬脑膜出现擦伤, 很可能是由于来自振动的过热。提高 ACSF 流的速率将解决此问题。
相量的主要限制是手机可以瘦骨, 但不能去除硬脑膜上的所有骨。金刚石涂层尖端有小颠簸。薄头骨所需的摩擦会擦伤硬脑膜, 如果用来去除所有的骨头, 会导致出血。因此, 需要使用镊子来去除剩余的薄层。虽然目前正在进行的辩论是否通过一个薄薄的头骨成像产生较少的炎症和小胶质细胞和反应性星形胶质的增殖较少, 在某些情况下, 一个没有骨头的窗口是首选, 例如, 以提供更深入的成像3.
我们为小鼠的光子成像优化了颅骨窗的制备。我们知道, 相量是第一次应用压电技术在啮齿动物的颅窗手术中进行光学成像。我们发现, 使用压电手术在小鼠共享的优势, 增加速度和减少不良事件也报告在人类7,8,9,10。压电装置的使用使手术速度更快 (图 2A), 而与高速旋转钻头相比, 出血的不良事件减少 (图 2B)。我们还发现, 在我们的实验室里, 新的外科医生比传统的颅骨窗手术方法更容易学到相量。在外科医生中, 速度和易用性的优势可能不同。薄头骨的准备工作通常需要30-45 分钟, 用钻头和手术刀2来薄骨, 而相量法通常需要少于10分钟。
我们发现, 在用相量制备的窗口中, 我们可以在运动皮层的4层锥体神经元中显示钙的瞬变, 这是用腺相关病毒编码钙指示器 JRGECO1a (AAV9。jRGECO1a. WPRE. SV40). 我们还发现, 与用旋转钻头和手术刀制作的薄壁颅骨窗相比, 成像区域更大, 而用旋转钻头和手术刀制作的薄头骨有一个20µm 直径的成像窗口2.用相量, 我们能够快速地薄3-4 毫米的面积。这与用端口4报告的图像窗口类似。这个更大的窗口保留了快速成像报告的好处为稀薄的头骨窗口准备用牙钻和手术刀。此外, 用相量编制的窗口可以立即成像, 而不是传统的骨移除窗口, 可能需要几周的时间来愈合, 然后窗口才能最佳地成像3。
该技术可用于研究硬脑膜下血管血流的变化。将相量的免疫反应与其他颅窗方法进行比较, 是今后研究的重要课题。这将是很重要的, 以确定相量是否产生较少的炎症相比, 现有的方法。我们希望, 在这里记录的压电手术技术将允许更多的实验室执行颅骨窗口和成功地使用多光子成像在体内。
确保手机设置为在最低设置上振动, 并且 ACSF 以恒定速率进行灌溉。冰冷 ACSF 必须不断地应用, 否则会加热并损坏硬脑膜。我们发现, ACSF 必须以至少1毫升/分钟的速度应用. 要么使用手里握着的注射器, 要么使用蠕动泵, 而不是手机内的内置灌溉。手机的灌溉系统 ACSF 太用力, 产生太多的湍流, 这将大大削弱能见度。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
塔玛拉 Zeric 帮助获得了该文中的光子图像。支持的大脑 & 行为, 帕金森和 JPB 基金会, R01 MH108186 和 R01 DA07418。F31 奖学金1F31MH109293-01A1 到 S C。
Materials
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Olympus | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
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