Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Alle Tierversuche unterlagen einer örtlichen ethischen Zustimmung und wurden unter den Bedingungen einer britischen Regierung Home Office Lizenz durchgeführt. 1. Hauternte und Kryokonservierung Vorbereitungen Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 25 ml 4% PFA und zwei 100-mm-Kulturschalen mit 25 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Füllen Sie rechteckige abziehbare Kryomaten um zwei Drittel mit optimaler Schnitttemperatur-Verbindung (OCT). Legen Sie eine Metallplatte, auf der die Kryoblöcke in einem späteren Schritt platziert werden können, in die -80 ° C Gefrierschrank. Hauternte, Fixierung und Kryokonservierung. Clip die dorsale Region der Tier-Leiche mit einem trockenen elektrischen Rasierer. ANMERKUNG: In diesem Beispiel wurden postnatale Tag 21 Wildtyp-Mäuse verwendet. Ernten Sie die interessanten Bereiche auf der Haut. HINWEIS: Die dorsomediale Region der Maushaut ( <stronG class = "xfig"> Abbildung 1a) enthält den höchsten Prozentsatz der Haarfollikel, die gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet sind, was eine optimale Ausrichtung für das Schneiden ermöglicht. Die Entfernung des zugrunde liegenden nicht-dermalen Gewebes ist nicht erforderlich, kann aber bei Bedarf durchgeführt werden. Schneiden Sie die geerntete Haut in rechteckige Stücke von passender Größe, um in den Boden der Kryomold passen, wobei das Richtungswachstum der Haarfollikel Getreide zu berücksichtigen. HINWEIS: Kleinere Hautscheiben sind für Anfänger einfacher zu handhaben, da sie sich während der Inkubations- und Montageprozesse weniger verwickeln. Das hier gezeigte Beispiel ist ein ~ 1 cm 2 Bereich der dorsalen Haut, der in eine 22 x 30 x 20 mm Kryomold passt ( Abbildung 2a ). Fixieren Sie die Haut bei Raumtemperatur in 25 ml 4% PFA für 10-30 min, abhängig von der Dicke der Hautproben ( Abbildung 1b ). Die Hautproben zweimal in 25 ml PBS waschenFür mindestens 5 min ( Abbildung 1b ). Tauchen Sie die Hautproben auf ein Papiertuch, um das Gewebe von überschüssigem PBS sorgfältig abzulassen, was zu einer Kristallisation während des Gefrierprozesses führen kann und die Ergebnisse der Kryosektion beeinflussen kann. HINWEIS: Ein Standard-Saccharose-Gradient ist nicht erforderlich. Dies kann aber auch nach eigenem Ermessen in das Protokoll aufgenommen werden. Achten Sie auf die Orientierung der Haarfollikel für jede Hautprobe. Verwenden Sie ein Seziermikroskop für visuelle Hilfe (vor allem jemand, der das Protokoll zum ersten Mal durchführt). Setzen Sie die Hautprobe in die OCT-gefüllte Kryomille ein und entbinden Sie alle Bereiche der Haut mit OCT, indem Sie Luftblasen entfernen, die an der Oberfläche des abgeschnittenen Haares mit einer Pinzette befestigt sind ( Abb. 2a und 2b ). Schieben Sie die Haut auf den Boden des OCT gefüllten Blocks, so dass es bündig mit dem Boden liegt. HINWEIS: Die Haut kann in jede Richtung ausgerichtet werdenS lang wie das Korn der Haarfollikel für richtige Schneidverfahren bekannt ist. Die Kryomillen werden neu ausgerichtet, wenn die Blöcke an den Kryostaten zum Kryoschweißen angeschlossen sind. Markiere die Haarfollikelorientierung auf der Kryomold, da dieser Schritt die nachfolgende Orientierung des Kryostatschnittes bestimmt. Übertragen Sie die Kryoblöcke auf die Metallplatte in der Gefrierschrank -80 ° C, um das Schwimmen und die Verlagerung des Gewebes zu vermeiden. Überwachen Sie den Einfrierprozess, um die Ausrichtung der Haut an der Unterseite der Kryomold aufrechtzuerhalten, da unsichtbare Luftblasen dazu führen können, dass die Haut auf die Oberfläche der Kryomille aufsteigt. HINWEIS: Kryomaten mit gefrorenem Gewebe können für mehr als ein Jahr bei -80 ° C gelagert werden und können für weitere Abschnitte wiederverwendet werden. Abbildung 1. Ernte und Fixierung der Maushaut. </stroNg> ( A ) Das Hautgewebe wurde aus der dorsomedialen Region des Tierkadaveres geerntet. Haarfollikel in diesem Bereich sind gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet und erlauben somit eine optimale Orientierung während des Schnittes, wie durch die Pfeile angedeutet. ( B ) Nach dem Schneiden von Quadraten einer geeigneten Grße, die in die Kryomille passt, wurde das Hautgewebe für 15 min in 4% PFA fixiert und zweimal in PBS für jeweils 5 min gewaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 2. Dickes Gewebe Querschnitt Vorbereitung und Gewebeorientierung auf den Kryostaten aufzubauen. Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 15 ml PBS vor. Legen Sie es auf einen leicht zugänglichen Bereich auf dem Kryostat. Zusätzlich wird eine 12-Well-Platte mit 2,5 ml PBS pro Well hergestellt; Etikett nach den Proben für die Langzeitlagerung der SeBei 4 ° C. Verwenden Sie Pinzette, um die Abschnitte zu behandeln. Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -20 ° C ein. HINWEIS: Die Temperatur kann den Schnitt beeinflussen, aber eine gute Anleitung ist bei -20 ° C zu starten. Um Abschnitte zu erhalten, die etwa zwei Haarfollikel dick sind, stellen Sie den Kryostaten so ein, dass er 150 μm dick ist. HINWEIS: Die Dicke des Abschnitts kann je nach Bedarf des Benutzers und den Einschränkungen des Mikroskops variiert werden, die für die Analyse verwendet werden. HINWEIS: Die Orientierung der Probe ist entscheidend für die Erzielung von Hautabschnitten mit Haarfollikeln in der entsprechenden Orientierung. Dies wird durch eine ordnungsgemäße Montage am Kryostatblock erreicht. Vergewissern Sie sich, dass die Schnittebene parallel zur Haarfollikelausrichtung ist ( Abbildung 2c ). Wie bereits erwähnt, ist die korrekte Ausrichtung der Sektionsebene in der Hautprobe ein entscheidender Schritt zur Bestimmung der Qualität der Bilder, die in der Haut aufgenommen werdenEinen späteren Schritt Abbildung 2. Einbettung, Kryokonservierung und Schnitt. ( A ) Die Markierung der Haarfollikel (HF) Richtung auf der Kryomold, die durch die schwarzen Pfeile angedeutet ist, ist für die richtige Orientierung während der Kryoschaltung wichtig. ( B ) Die Schnittebene muss mit der Haarfollikelorientierung ausgerichtet werden, um Abschnitte zu erzeugen, in denen die gesamte Länge der Haarfollikel intakt bleibt. ( C ) Abschnitte wurden pro Haarfollikelorientierung geschnitten, die durch die schwarzen Pfeile auf der Kryomold ( D ) Die dicken Gewebequerschnitte wurden mit Metallzangen gesammelt und ( e ) in eine 100 mm Kulturschale mit 1x PBS überführt. ( F ) Bei Raumtemperatur löst sich der PBS den OC ab.T. Die die dicken Gewebequerschnitte umgibt, wie durch die weißen Pfeile angedeutet. Die Abschnitte schweben dann frei im PBS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Kryoschweißen Schneide einen Abschnitt mit dem Kryostaten. Verwenden Sie Pinzette, um den OCT zu sammeln, der das eingebettete Stück der Haut enthält ( Abbildung 2d ). HINWEIS: Verwenden Sie einen Kryostaten, der eine unabhängige Bewegung und Einstellung entlang der X-, Y- und Z-Achsen ermöglicht, um eine optimale Probenpositionierung zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung von optimal ausgerichteten Gewebequerschnitten. Übertragen Sie den Abschnitt aus dem Kryostat in die 100 mm Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist, und fahren Sie mit der nächsten Scheibe fort. Sammeln Sie die Proben nicht auf einer Folie ( Abbildung 2e ). HINWEIS: Bei Raumtemperatur löst sich der PBS abDie OCT, verlassen Hautscheiben, die einfach zu handhaben mit Pinzette ( Abbildung 2f ). HINWEIS: Frische PBS kann in der 100 mm Kulturschale nach dem Auflösen vieler Gewebeabschnitte von 100 μm Dicke benötigt werden und kann entsprechend geändert werden. Verwenden Sie Pinzette, um die schwimmenden Hautabschnitte auf die korrekt markierte Vertiefung in einer 12-Well-Platte zu übertragen, die mit 2,5 ml PBS gefüllt ist ( Abbildung 3a , links). HINWEIS: Bei 4 ° C können die Proben für mindestens zwei Tage gelagert werden. Zur Langzeitlagerung von hauthaltigen OCT-Blöcken nach dem Schneiden die Schneidfläche mit einem Tropfen frischen OCT abdichten. Nach dem Einfrieren des OCT-Tröpfchens den gebrauchten OCT-Block in Parafilm einwickeln und in den Gefrierschrank von -80 ° C zurücklegen . 3. Immunfluoreszente Kennzeichnung. Bereiten Sie den PB-Puffer (PBS, ergänzt mit 0,5% Magermilchpulver, 0,25% Fischhautgelatine und 0,5% Triton X-100) bei leas vorT 2 h im voraus, wie zuvor beschrieben 5 . HINWEIS: Natriumazid kann dem PB-Puffer zur Antikörper-Konservierung für die wiederholte Verwendung des Färbepuffers zugesetzt werden. Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 μl PB-Puffer pro Röhrchen hinzu. Verwenden Sie vorsichtig Pinzetten, um die Hautscheiben aus dem PBS in separate Röhrchen zu bringen, die den PB-Puffer zum Blockieren enthalten ( Abbildung 3a , rechts). Stellen Sie sicher, dass alle Hautscheiben vollständig untergetaucht sind. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 10 Oszillationen pro Minute auf eine Wippe, die die Gewebeintegrität nicht stören sollte, für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die Geschwindigkeit nicht mehr als 10 Schwingungen pro Minute auf der Wippe übersteigt, da es zu Verwicklungen führen wird. Während es möglich ist, mehr als eine Scheibe pro Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen, um Antikörper zu sparen, legen Sie nur eine Scheibe pro Röhrchen. Um den Antikörperverbrauch zu verringern, verwenden Sie ein VolumeVon 250 & mgr; l HINWEIS: Falls erforderlich, ersetzen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit z. B. 96-Well-Platten. Die Platzierung der dicken Gewebequerschnitte in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ermöglicht jedoch die effektivste Antikörperpenetration in das Gewebe aufgrund der erhöhten Flüssigkeitsstörung. Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und fügen Sie 500 μl PB-Puffer und die entsprechende Menge an primärem Antikörper hinzu. Nach 1 h Blockierung die Hautscheiben in die frisch zubereiteten Röhrchen überführen, die die Antikörper enthalten. Die Scheiben bei 4 ° C über Nacht inkubieren. HINWEIS: In diesem Beispiel wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: FITC-Ratten-Anti-Human-CD49f bei einer Konzentration von 1:50 und Ziegen-anti-Maus / Rattenintegrin alpha 8 bei einer Konzentration von 1: 100. Am nächsten Tag werden zwei getrennte 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, die 500 μl PBS pro Probe enthalten. Die Hautscheiben zweimal für 1 h bei Raumtemperatur waschenE. Bereiten Sie getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 500 μl PB-Puffer mit der entsprechenden Konzentration an anwendbaren sekundären Antikörpern und 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten. ANMERKUNG: Die in diesem Beispiel verwendeten sekundären Antikörper sind Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ratten-IgG und Alexa Fluor 555 Esel Anti-Ziegen-IgG in einer Konzentration von 1: 500. DAPI wurde in einer Konzentration von 1: 100 verwendet. Sorgfältig die Hautproben in den PB-Puffer überführen, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält und die Hautscheiben bei Raumtemperatur für 1 h bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotator oder Schüttler inkubieren. Die Scheiben bei 4 ° C im PB-Puffer, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält, für bis zu vier Tage aufbewahren und eventuell länger, wenn Natriumazid dem PBS zugesetzt wird. Abbildung 3. ImmunfluoreszenzEtikettierung und Montage. ( A ) Die schwimmenden Gewebequerschnitte können in 12-Well-Platten für mindestens zwei Tage bei 4 ° C gelagert werden. Vor der Immunfluoreszenz-Markierung (IF) können die interessierenden Gewebequerschnitte in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen, die PB-Puffer zum Blockieren enthalten, übertragen, wie durch Pfeil 1 angedeutet. Für die IF-Markierung haften Sie an dem in Schritt 3 ausgearbeiteten mehrstufigen Verfahren Teil von Schritt 3 erfordert die sorgfältige Übertragung der Gewebequerschnitte in frisch präparierte Mikrozentrifugenröhrchen, die primäre Antikörperlösung, sekundäre Antikörperlösung oder Waschpuffer enthalten, was durch Pfeil 2 angedeutet ist. ( B ) Nach der IF-Markierung wird die Gewebe- Abschnitte werden in einem Tröpfchen von Glycerin unter Verwendung eines Sektionsmikroskops aufgehoben und abgeflacht. ( C ) Sobald der Gewebequerschnitt vollständig auf den Boden eines Deckglases abgeflacht ist, wird ein regelmäßiger Mikroskop-Objektträger zur Befestigung des Abschnitts verwendet. <aHref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Montage für mikroskopische Visualisierung Vor der Bildgebung werden die Hautscheiben auf getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, die 500 μl PBS enthalten, um die sekundären Antikörper und DAPI zu waschen. Verwenden Sie eine 1000 μl Pipette, aber schneiden Sie die ersten 0,5 cm der Pipettenspitze ab, um das richtige Pipettieren des hochviskosen Glycerins zu ermöglichen. Legen Sie ein 22 x 50 mm Deckglas auf einen dunklen Hintergrund unter einem Sektionsmikroskop ( Abbildung 3b ). Füge ein Tröpfchen von 100% Glycerin auf den Deckzettel hinzu ( Abbildung 3b ). Übertragen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf das Glycerintröpfchen. Verwenden Sie das Seziermikroskop und spitzen Pinzette, um sorgfältig die Haut Scheiben, die zusammengerollt sind, abwickeln. HINWEIS: Als die Scheibe im Gly schwimmtCerol Tröpfchen, kann es entwirrt werden, indem die natürliche Neigung des Gewebes, um seine normale Form zurückzukehren. Die unnatürliche Begradigung der Scheibe nicht zwingen, da dies das Gewebe beschädigen könnte. Montieren Sie das Gewebe, sobald die gesamte Länge des Hautabschnitts richtig ausgerichtet und auf dem Deckel abgeflacht ist; Verwenden Sie eine regelmäßige Mikroskop-Folie. Dieser Schritt wird die Hautscheibe weiter begradigen. HINWEIS: Vermeiden Sie Lufteinschlüsse ( Abbildung 3c ). Bild die in Glycerin-montierten Hautabschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage. HINWEIS: Eine längere Lagerung wird die Gewebe- und Abbildungsqualität negativ beeinflussen. In diesem Beispiel wurden alle Bilder mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 20x Objektivs erworben.