Профилирование IgG против Neu5Gc в человеческой сыворотке с помощью анализа сиалогликанового микрочипа

Sias – кислые сахара, покрывающие гликановые цепи на гликопротеинах клеточной поверхности и гликолипидах у позвоночных. Экспрессия Sia модифицируется в раковых клетках ¹ и коррелирует с прогрессированием и / или метастазами ^{2 , 3} . Двумя основными формами Sia у млекопитающих являются Neu5Ac и его гидроксилированная форма Neu5Gc ² . Люди не могут синтезировать Neu5Gc из-за специфической инактивации гена, кодирующего фермент CMAH. Этот нечеловеческий Sia метаболически включает в клетки человека как «я», происходящие из диетических продуктов, богатых Neu5Gc ( например, красного мяса) ^{4 , 5} . Neu5Gc присутствует на низких уровнях на клеточных поверхностях эпителия человека и эндотелии, но он особенно накапливается в карциномах. Neu5Gc признан чужеродным гуморальной иммунной системой человека ^{2 , 6} .Антигенная сложность Neu5Gc-гликанов может возникать на нескольких уровнях, включая модификацию Neu5Gc, связывание, лежащие в основе гликаны и каркасы, и их плотность, что отражается на сложности ответа антитела против Neu5Gc у людей ⁶ . Некоторые из этих антител являются биомаркерами карциномы и потенциальными иммунотерапевтическими средствами ⁷ . Появление химиоферментального синтеза различных сиалогликанов ⁸ способствовало более глубокому анализу таких антител, чему способствовало использование технологии микрочипов гликана ^{9 , 10} . Таким образом, благодаря облегченной подготовке и манипулированию большими библиотеками природных и синтетических углеводов глианные микрочипы стали мощной высокопроизводительной технологией для исследования взаимодействия углеводов с множеством биомолекул ^{10 , 11 ,} </sup> ^{12 , 13} . В формате массива используются минимальные количества материалов, и этот многовалентный дисплей биологически релевантных гликанов позволяет исследовать тысячи связывающих взаимодействий в одном эксперименте. Важно отметить, что эта технология также может быть применена к обнаружению биомаркеров и для мониторинга иммунных ответов в различных образцах ^{7 , 12} .

Успешное изготовление микрочипов в гликанах требует рассмотрения трех важных аспектов: типа робота-принтера, химии конъюгации гликанов и оптики обнаружения. Что касается рассмотрения печатного инструмента, доступны два метода: контактные и бесконтактные принтеры. При контактной печати 1-48 стальных штифтов погружают в пластину с множеством колодцев, содержащую раствор гликанов, и высевают на функционализированные стеклянные слайды, непосредственно контактируя с поверхностью стекла. Сумма решения deСжиженный на слайде, является функцией продолжительной продолжительности на поверхности скольжения. Обычно образцы сначала предварительно фиксируются на стеклянном блоке (чтобы достичь однородных пятен), прежде чем они будут напечатаны на поверхности скольжения. В бесконтактных принтерах ( например, пьезоэлектронный принтер) гликаны печатаются из стеклянного капилляра с использованием контролируемых электрических сигналов. Электрический сигнал может быть точно калиброван для достижения более точной печати относительно контактной печати. Размер и морфология пятен также относительно более однородны. Дополнительным преимуществом является повторная рециркуляция образца обратно к исходной пластине после печати. Тем не менее, основным недостатком пьезоэлектронных принтеров является ограничение на печать (4 или 8), что приводит к очень длительной длительности печати, что требует особого внимания стабильности скольжения, температуры, влажности и испарения образца. Бесконтактный струйный принтер требует больших объемов выборки ¹⁴ .

<p class = "jove_content"> В отличие от ограниченных доступных вариантов методов печати, химия конъюгации гликанов является более сложным соображением, с множеством вариантов на выбор. Отобранная химия иммобилизации должна учитывать как активные группы на гликанах, так и реактивность поверхности скольжения. Гликаны, которые должны быть иммобилизованы на определенную поверхность микрочипа, синтетически синтезированную или естественно изолированную, требуют одинаковой реактивной группы. Кроме того, гликаны должны быть чистыми и гомогенными. С другой стороны, поверхность иммобилизации и химия должны обеспечивать воспроизводимость и надежную плотность крепления. Были разработаны множественные методы иммобилизации с использованием ковалентного или нековалентного (физического поглощения) ^{10 , 11 , 12 , 13} . Для получения более подробной информации о печатной технологии микрочипов гликана для непосвященныхD следователь, см. Эти превосходные обзоры ^{13 , 15} . Важно отметить, что недавняя минимальная информация, необходимая для инициативы Glycomics Experiment (MIRAGE), описывает руководящие принципы для подготовки образцов ¹⁶ и для представления данных из анализа микрочипов гликана ¹⁷ для улучшения стандартов в этой растущей области.

Здесь мы опишем подробный протокол для изготовления микромассивов сиалогликана с использованием специального контактного нанопринтера в формате с 16 ячейками. Каждый из гликанов имеет первичный амин, который опосредует их ковалентную связь с стеклами, активированными эпоксидным стеклом. Мы также описываем разработку и анализ одного слайда с использованием различных образцов сыворотки крови, антител и лектинов, связывающих Sia-связывание. Анализы микроматрицы Sialoglycan включают в себя несколько основных этапов, которые включают в себя изготовление, обработку, разработку и анализ массивов. Изготовление массивов требует планированияЛучевой макет, подготовка гликанов и исходной пластины, программирование нано-принтера и печать слайдов. Затем слайды обрабатываются, разрабатываются и анализируются ( рис. 1 ).