bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi
Summary
Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.
Abstract
Canlılığı sağlamak için organizmalar, tutarlı bir gıda kaynağı temin ederken, olumsuz habitatlardan kaçınabilmelidir. Caenorhabditis elegans , çeşitli çevresel uyarıların saptanması üzerine lokomotif kalıplarını değiştirir ve açlık koşullarına cevaben davranışsal tepkiler setini modüle edebilir. Nematodlar tipik olarak, bir gıda kaynağından 30 dakika boyunca çıkarıldığında azaltılmış aversive yanıtı sergiler. Değişen bir beslenme durumuna yanıt olarak davranış değişikliklerinin gözlenmesi, iyi beslenmiş bir durumdan aç bırakılan bir duruma geçişi düzenleyen mekanizmalara dair bilgiler sağlayabilir.
Nematodun caydırıcı bir bariyerden ( mesela bakır) geçme yeteneğini ölçen bir deney geliştirdik ve daha sonra uzunca bir süre bir gıda kaynağına ulaştık. Bu protokol, önceki çalışmalara, organizmaların bir aya doğru kaymasıyla devam eden veri toplamanın yapılmasına izin verecek şekilde çoklu değişkenleri entegre ederek oluşturmaktadırGiderek açlık çeken durum. Dahası, bu tahlil, daha büyük popülasyon nematodların eşzamanlı olarak değerlendirilebilmesi için, numune sayısının arttırılmasına izin verir.
Bakır tespit etme veya tepki verme yeteneğine sahip olmayan organizmalar, kimyasal bariyerden geçerler, vahşi tip nematodlar başlangıçta itilir. Vahşi tip solucanlar giderek açlığa kavuştuğundan bariyerini aşmaya ve besin kaynağına ulaşmaya başlarlar. Bu tahlil, gıda sansasyonu veya caydırıcı kimyasalların saptanması da dahil olmak üzere çeşitli çevresel ipuçlarına cevap veremeyen bir mutantı değerlendirmek üzere tasarlandı. Bu protokol aracılığıyla değerlendirildiğinde, kusurlu organizmalar hemen engelden geçtiler, ancak bir gıda kaynağını bulamıyorlardı. Dolayısıyla, bu mutantlar geçici olarak bir besin kaynağına ulaşmalarına rağmen kimyasal bariyerini tekrar tekrar aşar. Bu tahlil, kaçınma ve açlık ile ilgili potansiyel yol hatalarını değerlendirmek için solucan popülasyonlarını basitçe test edebilir.
Introduction
Caenorhabditis elegans , sadece 302 nöron 1'den oluşan bir sinir sisteminin devresini analiz etmede göreli kolaylık nedeniyle onlarca yıldır nörobiyolojinin çalışması için bir model olarak kullanılmıştır. Organizmanın çevresel ipuçlarına tepki vermeye güvenmesi koşuluyla, sinir sisteminin büyük bir kısmı çevresel sinyallere entegrasyonu düzenlemekle yükümlüdür 2 . Sinir sisteminin sadeliğine rağmen, C. elegans , kovucular 3 , cezbediciler 4 , sıcaklık 5 ve hatta nem 6 da dahil olmak üzere çeşitli çevresel sinyaller algılar ve bunlara cevap verebilir. Doğru çevreye sinyalleri entegre bir başarısızlık memeli model sistemlerinde 7 9 davranışsal bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklardan bir dizi ile bağlantılı olmuştur. Bir dizi mevcut nevral hastalık modeli ile 10 C. elegans'da ve nematod farmasötik eleklerinin 11 gelişiminde, bu organizmanın nörobiyolojinin çalışması için yararlı bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Nematod genomu 12'de eşlenen bir nematod bağlantı 1 ve mutasyonların neredeyse her bir geninin varlığı göz önüne alındığında, nematod sinir sistemini ve kendi uzantımızı anlayışımız kısmen yaratıcı uygun tahliller tasarlamakla sınırlıdır.
Çeşitli caydırıcı uyaranlara nematod tepkilerini değerlendirmek için son 40 yılda bir dizi kemotaks testi geliştirildi 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . İlk deneme, akut bir çevresel uyaranın ortaya çıkmasına neden olurken, tek bir solucan bir agar plakasında gezindi= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Lokomotif cevaplardaki ani değişiklikler kaydedildi. Örneğin, uçucu koku oktanol bir saç teline uygulanabilir ve yabani tip solucanlarda geriye doğru hareket hareketini başlatmak için bir nematodun burnunun önüne fırlayabilir 17 . Daha karmaşık tahlilleri de davranışsal seçim 18 değerlendiren bir araç olarak birden çok değişkeni birleştirmek için geliştirilmiştir. Bu tahlilin bir varyasyonu, caydırıcı bir orta hat bariyeri 4 oluşturmak için bir bakır solüsyonunun kullanılmasını gerektirir. Bir çekici, yani diasetil, kimyasal bariyerin bir tarafına kondu ve solucanlar diasetil kaynağından uzaklaştırıldı. Kurşunsuz yanıt için arızalı solucanlar hemen diasetil ulaşmak için engel geçti, vahşi tip solucanlar başlangıçta bariyer tarafından itildi. Solucanlar ilk önce bakır bariyere yaklaştığında tepkiler alındıUzun süreli gözlem olmadan.
Açlık koşullarından sonra solucanlar değerlendirildiğinde çevresel uyaranlara olan duyarlılığı azaltılır 19 . Caner oktanol, nematod burununun önüne savurulduğunda, yabani tip organizmalar gıdaya çıktığında 3-5 saniye içinde geriye doğru harekete neden olurlar. Bu organizmalar 10 dakika süreyle gıdalardan çıkarıldıktan sonra 8-10 s'lik bir gecikmeli yanıt veriyorlar 20 . Böylece, açlıktan arttıkça, nematodlar zararlı çevresel sinyallere karşı azaltılmış aversive bir yanıt sergilemektedir; çünkü gıda araması hayatta kalmak için daha önemli hale gelir. Tersine, nöropeptid reseptör 9'u ( npr-9) aşırı miktarda eksprese eden nematodlar, gıda üzerindeki veya dışı oktanol üzerine cevap vermez ve birtakım aversif uyaranlara cevap vermede yetersizlik sergiler 21 . Bu npr-9 (GF) organizmaları aynı zamanda, gıda varlığında reversal frekanslarını modüle etmezler, ancakSert dokunuş uyarılarına karşılık olarak geriye doğru hareket etme yeteneğine sahip olduklarını gösterir 21 . Ayrıca npr-9 (LF) mutantlar, gıda 21 varlığında davranışlarını modüle edebilir ancak gıda dışı bir anormal seviyede azalmış ters frekans sergileyen verilen değerlendirilmiştir. Akut dış uyaranların tanıtımıyla solucanının beslenme durumunu bağlanması, bir gıda ile ilgili yol genel olarak duyu sinyallemesini modüle hangi mekanizma ile açıklık destekli olan 23, 22 geçiş yolu. Nematod ortamında gıdaların varlığı da etanol geri çekilme yanıtlarını değerlendirmek için kullanılmıştır 24 . Bu deneyde, solucanlar çeşitli konsantrasyonlarda etanol içinde kuluçkalanır ve daha sonra bir "gıda yarış tahlili" olarak bilinen bir gıda yamasına sahip bir agar plakası üzerine yerleştirilir. Yemek yaması plakanın bir kenarına yerleştirilirken nematodlar wYiyecek kaynağından uzak durdu. Etanol çekimi, solucanların yiyecek yamasına ulaşmaları için gereken süreyi ölçerek değerlendirildi.
Bu beslenme esasına dayanan bakır kaçınma analizi, zaman içindeki davranış değişikliklerini değerlendirirken ek çevre değişkenlerini (gıda ve bakır) entegre etmek için gıda yarış testine dayanıyor. Bu C. elegans topluluğu genelinde yaygın olarak kullanılan bir protokolün uyarlanmasıdır 4 . Bu protokol, caydırıcı tepkiler ve dört saatlik bir süre üzerinde 21 gıda saptanmasını değerlendirmek için kullanılmıştır. Solucan, 30 dakika gıda yoksunluğundan 25 sonra açlık davranışları sergilediğinden, beslenme durumundaki değişikliklerin çevresel cevapları nasıl etkileyebileceğini de değerlendirebiliyoruz. Bu deneyin koşulları, deneysel organizmaların zaman içinde aversive uyaranlara yanıt verme şeklini ölçer, bu nedenle davranış değişiklikleri şu şekilde değerlendirilir:Organizmalar açlık durumuna doğru ilerledikçe (ve uzun süren açlık ölçümlerine devam ederler). Npr-9 (GF) hayvanları, besin ya da birçok caydırıcı ipucu karşısında davranışlarını değiştirmediğinden, bu davranış açıklarının açlık bağlamında devam edip etmeyeceğini tespit etmeye çalıştık. Sonuçta, bu tahlil tasarımı npr-9 (GF) mutantlarını spesifik olarak değerlendirmek üzere formüle edilmiştir, ancak yeni suşları karakterize etmek için daha da uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tahlil tasarımı, gıda yarış tahlilini 24 , nefis bir orta hat bariyeri oluşturmak için bir bakır solüsyonu ve nematodların kaybını önlemek için plakanın kenarı etrafında değiştirir. Canlılar, caydırıcı bariyerden geçme ve 4 saatlik bir sürede bir yemeğe erişme yetenekleri açısından test edilir. Npr-9 (GF) bağlamında, açlığın aversive yanıtları nasıl etkilediğini ve gıdanın tespitini değerlendirmek için bu tahlilden yararlandık. Daha önce <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından Discovery Grant RGPIN36481-08 tarafından William G. Bendena'ya desteklenmiştir.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
