JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

Published: October 10, 2017
doi:
10.3791/55932
, ,
1Systems Biotechnology Research Center,KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School,Korea University of Science and Technology

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

Abstract

טאו חלבונים הקשורים microtubule הוא חלבון עצביים רגישה בעיקר ב אקסונים. בדרך כלל טאו הוא חיוני לתפקוד נורמלי עצביים מכיוון מעורב microtubule הרכבה, מייצב. מלבד הנוירונים, טאו מתבטא בשד האנושי, הערמונית, קיבה, המעי הגס, סרטן הלבלב איפה זה מציג מבנה דומה כמעט ולא מפעילה פונקציות דומות כמו טאו עצביים. הסכום של טאו שלה זרחון יכול לשנות את תפקידה בתור מייצב של microtubules ולאחר להוביל להתפתחות של חוטים לוליינית לזווג הפרעות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר. קביעת המדינה זירחון של טאו ומאפייניה microtubule מחייב חשוב. בנוסף, בחינת ההתאמה תאיים של טאו היא חשובה מחלות שונות. זה כתב היד פרטים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור מדידת זרחון טאו טאו מחייב microtubules בתאי סרטן המעי הגס עם או בלי כורכומין וטיפול LiCl. טיפולים אלה יכולים לשמש כדי לעצור את התפשטות תאים סרטן ופיתוח. לוקליזציה תאיים של טאו נבדק על-ידי שימוש אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך שימוש כמויות נמוכות של נוגדנים. מבחני אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון תרכובות המשפיעים על hyperphosphorylation טאו או microtubule מחייב. הריפוי משמש tauopathies שונים או סוכנים נגד סרטן הקשורים יכול באופן פוטנציאלי להתאפיין באמצעות פרוטוקולים אלה.

Introduction

טאו זוהה במקור בחום-היציב הקשורים microtubule חלבון זה היה מזוכך במשותף עם טובולין1. טאו מתבטא באופן בלעדי גבוה פרוקריוטים2,3,4. הפונקציה העיקרית של טאו היא לשלוט microtubule הרכבה1,5,6. זה גם תורם פלמור של microtubules7, תחבורה עצב8, שינויים בעצב בקוטר9, היווצרות נירומה קוטביות, הקשורים ניוון מוחיים10. טאו פועלת גם בדומה לפיגום חלבון כדי לשלוט איזה איתות המסלולים. עכברוש המוח מחקרים מראים את טאו הוא נוירון ספציפי, זה בעיקר. רגישה אקסונים11. מכיוון טאו הוא חיוני microtubule הפילמור ופיתוח עצביים, טאו היה שיערו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות עצב במערכת העצבים המרכזית; השערה זו היה אח כ אומתה על ידי ניסויים במבחנה , ויוו . בנוסף הנוירונים, טאו מתבטא תאים שאינם עצביים שונים, כולל הכבד, הכליה שרירים תאים12,13. טאו, מתבטאת גם אנושי השד, הערמונית, המעי הגס, קיבה, ו סרטן הלבלב תא קווים ורקמות14,15,16,17,18, 19. טאו נמצא גם הכללה-הגוף לומבגו כמו tubulofilaments מעוות הכללה גופות20.

טאו עשוי לבצע מספר שינויים post-translational. של כל השינויים post-translational, זרחון היא הנפוצה ביותר. טאו מוגברת זרחון מקטין את האהדה microtubules, בסופו של דבר יציב את שלד התא. אתרי זירחון 85 תוארו חלבון טאו מבודד ברקמות המוח האנושי מחלת אלצהיימר. האתרים האלה 53% מהווים סרין טראונין 41%, רק 6% טירוזין שאריות21,22,23. טאו זרחון משפיעה על לוקליזציה שלה, פונקציה, איגוד, המסיסות, והרגישות שלו כדי שינויים post-translational אחרים. גם טאו זירחון כדי יותר במידה נורמלית (או רווי לחלוטין עם קבוצות פוספט) המכונה hyperphosphorylation משכפל מאפיינים מבניים ופונקציונליים של מחלת האלצהיימר24. טאו שומר על התפקוד התקין של microtubules עצב ומבטיחה לתפקוד תקין עצביים בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, טאו hyperphosphorylated מצליח לשמור על איגוד microtubule מאורגן היטב, גרימת הפסד עצביים בגלל microtubule פירוק. רמות נורמליות של טאו זרחון נדרשים עבור טאו תקין בתפקוד, אך טאו לא יצליח לתפקד באופן נורמלי, אם רמת זירחון האופייני שלו היא שונה, ואם זה hyperphosphorylated25. מחלת אלצהיימר, הפרעות ניווניות הקשורות לגיל אחרים, טאו הופך hyperphosphorylated, יוצר חוטים לוליינית לזווג בין קשרים neurofibrillary26,27. לכן, שיטות לקביעת טאו זרחון ואיגוד microtubule חשובים.

סרטן המעי הגס, סרטן הקשורים להזדקנות, הוא שהשלישי מרבה אובחן סרטן וסרטן את השלישי בולטים גורמי המוות עבור גברים ונשים כאחד28. סרטן המעי הגס הוא אחד של סרטן סיבת המוות העיקרית העולם המערבי29. כי סרטן המעי הגס וגם מחלת אלצהיימר קשורים עם ההזדקנות ובמקרה שניהם בעיקר במדינות המפותחות בה אנשים נהנים הרגלי התזונה דומה, ייתכן ושתי המחלות איכשהו בקורלציה. בנוסף, תאים סרטניים טאו-חיוביים ושליליים -טאו להגיב באופן שונה על סוכנים כימותרפיות, למשל, פקליטקסל16.

כורכומין הוא אחד נגזרות הראשי של כורכום longa, כורכום תבלין הודי30. במשך מאות שנים, אוכלוסיות בדרום אסיה יש לצרוך כורכום בדיאטה שלהם על בסיס יומי. כורכומין משמש לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן המעי הגס, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סיסטיק פיברוזיס, מחלות מעי דלקתיות, דלקת פרקים, היפרליפידמיה, טרשת עורקים, מחלת לב איסכמית31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. ליתיום יכול גם להרוג תאים סרטן המעי הגס או למנוע את התפשטות39. ליתיום יכול לשמש גם לטיפול מחלת אלצהיימר40 כפי שהוא מקטין צבירת טאו מונע hyperphosphorylation שלה, כפי שנצפתה על העכבר הטרנסגניים דגם41,42,43, 44.

כתב יד זה שואף: 1) למדוד את טאו הכולל ואת רמות ביטוי פוספו-טאו בתאים שטופלו; 2) לתאר וזמינותו פוספטאז למדוד זרחון טאו הכללית; 3) לבחון microtubule-איגוד של טאו; . ו-4) בתרגום טאו מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית בשורות תאים סרטן המעי הגס, מטופלים עם כורכומין או LiCl. תוצאות חושפים כי טיפול תאי עם כורכומין, אשר הוא סוכן טוב כביכול כימותרפיות לסרטן המעי הגס, טיפול עם LiCl יכול להפחית את הביטוי של טאו הכולל שני, phosphorylated טאו בשורות תאים סרטן המעי הגס. טיפולים אלה יכול גם לגרום רוברטסונית הגרעין של טאו. עם זאת, באופן בלתי צפוי, כורכומין נכשל לשפר את הכריכה של טאו כדי microtubules.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים µL µL להוסיף 10 בפתרון פלואוריד phenylmethylsulfonyl (1 מ מ), 10 (1 x 100 x מניות) של פתרון קוקטייל של מעכבי פרוטאז, µL 10 (1 x 100 x מניות) של פוספטאז פתרון קוקטייל מעכב 1 מ”ל 1 x radioimmunoprecipitation assay (ריפה) המאגר כדי להכין מאגר שלם של פירוק ריפה. הכן 10 x טובולין כללי מאגר (PEM) מאגר. ?…

Representative Results

ביטוי הכולל טאו טאו פוספו נבדקה לאחר טיפול תאי עם ריכוזים שונים של כורכומין או LiCl (איור 1). טיפול של תאים עם שלושה ריכוזים שונים של כורכומין ירד טאו רמות הביטוי; עם זאת, הביטוי פוספו-טאו מוגברת בעת טיפול עם ריכוז נמוך של כורכומין אך ירד על טיפול תאים עם ריכוז …

Discussion

כתב יד זה הוקמה תנאים פרוצדורליים שונים לגילוי טאו הכולל ואת phosphorylated טאו בתאי סרטן המעי הגס שטופלו כורכומין, LiCl. כדי להעריך את המצב זרחון הכוללת של טאו בדגימות חלבון, תוארה של assay פוספטאז. Assay הזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי לבחון את המצב זירחון של כל חלבון.

Assay זו מבוססת על ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה בוצע כפי חלק מהפרוייקט שכותרתו ‘פיתוח ו ה תיעוש של חומרי גלם קוסמטיים ערך גבוה מ microalgae ימית’, ממומן על ידי משרד של אוקיינוסים, חלוצת, קוריאה, נתמך על ידי מענק מגזר (2Z04930) ממוסד KIST Gangneung של מוצרים טבעיים.

Materials

HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X – 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  29. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  30. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  31. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  32. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  33. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  34. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  35. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  36. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  37. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  38. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  39. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  40. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  41. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  42. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  43. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  45. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  46. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  47. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  48. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  49. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  50. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Tau PhosphorylationMicrotubule BindingTau LocalizationConfocal MicroscopyColorectal Cancer CellsPhosphatase AssayMicrotubule-binding AssayTau ProteinHCT 116 CellsCurcuminLithium ChlorideRIPA BufferBradford AssayAlkaline Phosphatase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image