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생화학

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

Published: October 10, 2017
doi:
10.3791/55932
, ,
1Systems Biotechnology Research Center,KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School,Korea University of Science and Technology

Summary

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

Abstract

La proteína asociada a microtúbulos tau es una proteína neuronal que se localiza sobre todo en los axones. Generalmente tau es esencial para el funcionamiento neuronal normal porque está implicada en la estabilización y el montaje del microtubule. Además de las neuronas, tau se expresa en mama, próstata, gástrica, colorrectal y los cánceres de páncreas donde se muestra la estructura casi similar y ejerce funciones similares como el tau neuronal. La cantidad de tau y su fosforilación puede cambiar su función como estabilizador de microtúbulos y conducir al desarrollo de filamentos helicoidales apareados en trastornos neurodegenerativos diferentes, como la enfermedad de Alzheimer. Es importante determinar el estado de fosforilación de tau y sus características de unión a microtúbulos. Además, examinar la localización intracelular de tau es importante en diferentes enfermedades. Este manuscrito detalles protocolos estándar para la medición de la fosforilación de tau y de la Unión de tau a los microtúbulos en las células de cáncer colorrectal con o sin tratamiento de LiCl y curcumina. Estos tratamientos pueden utilizarse para detener el desarrollo y proliferación de células de cáncer. Localización intracelular del tau se examina mediante el uso de inmunohistoquímica y microscopía confocal durante el uso de bajas cantidades de anticuerpos. Estos ensayos pueden usarse repetidamente para la detección de compuestos que afectan la hiperfosforilación de tau o atascamiento de microtúbulos. Terapéutica de la novela utiliza para diferentes Tauopatías o relacionados con agentes anticancerígenos potencialmente pueden ser caracterizados mediante estos protocolos.

Introduction

Tau fue identificado originalmente como una proteína asociada a microtúbulos estables al calor que fue co purificada con tubulina1. Tau se expresa exclusivamente en eucariotas superiores2,de3,4. La función principal del tau es controlar microtúbulos Asamblea1,5,6. También contribuye a la polimerización de microtúbulos7, transporte axonal8, cambios en el diámetro axonal9, formación de polaridad de neuroma y neurodegeneración10. Tau también actúa como un andamio de proteínas para el control de algunas vías de señalización. Estudios de cerebro de rata sugieren que tau es específica de la neurona y que principalmente se localiza en axones11. Porque es esencial para el desarrollo neuronal y polimerización de microtúbulos tau, tau fue presumido para desempeñar un papel importante en el desarrollo axonal en el sistema nervioso central; Esta hipótesis fue posteriormente verificado por experimentos in vitro e in vivo . Además de las neuronas, tau se expresa en diversas células no neuronales, incluyendo hígado, riñón y músculo células12,13. Tau se expresa también en mama, próstata, colorrectal, gástrica y cáncer pancreático células líneas y tejidos14,15,16,17,18, 19. tau también se encuentra en myositis del cuerpo de inclusión como trenzado tubulofilaments en cuerpos de inclusión20.

Tau puede llevar varias modificaciones poste-de translación. De todas las modificaciones post-traduccionales, fosforilación es la más común. Fosforilación de tau mayor disminuye su afinidad por los microtúbulos, finalmente desestabilizar el citoesqueleto. Se han descrito sitios de fosforilación de ochenta y cinco en aislados de los tejidos del cerebro humano la enfermedad de Alzheimer la proteína tau. De estos sitios, 53% son serina, treonina 41% y sólo 6% tirosina residuos21,22,23. Fosforilación de Tau afecta a su localización, función, enlace, solubilidad y su susceptibilidad a otras modificaciones poste-de translación. También la fosforilación de tau a más de lo normal (o completamente saturado con grupos fosfato) se conoce como la hiperfosforilación que imita las características estructurales y funcionales de la enfermedad de Alzheimer24. Mantiene el buen funcionamiento de los microtúbulos axonales y asegura el funcionamiento neuronal normal bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, tau hiperfosforilada es incapaz de mantener un enlace de microtúbulos bien organizado, causando la pérdida neuronal por desmontaje de microtúbulos. Niveles normales de la fosforilación de tau se requieren para tau correcto funcionamiento, pero tau no funciona normalmente si se altera su nivel de fosforilación característico y si está hiperfosforilada25. En la enfermedad de Alzheimer y algunos otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad, se convierte en hiperfosforilada y forma los filamentos helicoidales apareados y los enredos de neurofibrillary26,27. Por lo tanto, métodos para la determinación de la fosforilación de tau y Unión de los microtúbulos son importantes.

Cáncer colorrectal, un cáncer asociado a envejecimiento, es que la tercera más frecuentemente diagnosticado cáncer y el tercer prominente que causan la muerte para hombres y mujeres28. El cáncer colorrectal es uno de los principales cánceres causantes de muerte en el mundo occidental29. Porque el cáncer colorrectal y la enfermedad de Alzheimer están asociados con el envejecimiento y ambos suceden principalmente en los países desarrollados donde disfrutar de los hábitos alimentarios similares, las dos enfermedades de alguna manera pueden correlacionarse. Además, las células cancerosas tau-positivas y negativas de tau responden de diferente manera a los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, paclitaxel16.

La curcumina es uno de los principales derivados de la longa de la cúrcuma, la especia India cúrcuma30. Durante siglos, las poblaciones del sur de Asia han consumido cúrcuma en su dieta diariamente. La curcumina se usa para tratar diferentes enfermedades, incluyendo cáncer colorrectal, la enfermedad de Alzheimer, diabetes, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, hiperlipidemia, aterosclerosis y cardiopatía isquémica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litio también puede matar a las células de cáncer colorrectal o prevenir su proliferación39. Litio puede usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer40 ya que disminuye la agregación de tau y previene su hiperfosforilación como se observa en un ratón transgénico modelo41,42,43, 44.

Este manuscrito tiene como objetivo: 1) medir la tau total y niveles de expresión de fosfo-tau en células tratadas; 2) describe un ensayo de fosfatasa para medir la fosforilación de tau total; 3) examinar microtubule-obligatorios de tau; y 4) localizar tau mediante microscopía confocal en líneas celulares de cáncer colorrectal tratados con curcumina o LiCl. Los resultados revelan que célula el tratamiento con curcumina, que es un agente quimioterapéutico supuestamente bueno para el cáncer de colon, y tratamiento con LiCl puede reducir la expresión de ambos tau total y fosforila tau en líneas celulares de cáncer colorrectal. Estos tratamientos también pueden causar desplazamiento nuclear de tau. Sin embargo, inesperadamente, la curcumina no mejorar la Unión de tau a los microtúbulos.

Protocol

1. preparación de los reactivos añadir 10 μl de solución de fluoruro de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 μl (1 x de acción x 100) de solución Cóctel de inhibidor de la proteasa y 10 μl (1 x de acción x 100) de fosfatasa solución coctel inhibidor a 1 mL de tampón de ensayo (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 preparar el buffer de lisis RIPA completo. Prepare 10 x buffer de buffer (PEM) de tubulina general. Add 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' – bis – 2-(n-2-h…

Representative Results

Expresión de tau total y fosfo-tau fue examinado después de tratar las células con diferentes concentraciones de curcumina o LiCl (figura 1). Tratamiento de células con las tres concentraciones diferentes de la curcumina disminuye los niveles de expresión de tau; expresión de fosfo-tau aumentó sobre el tratamiento con baja concentración de curcumina pero disminuyó al tratar las células con concentraciones más altas de la curcumina. Anti-fosfo-tau (…

Discussion

Este manuscrito establece diferentes condiciones procedimentales para la detección de tau total y fosforila tau en células de cáncer colorrectal tratados con curcumina y LiCl. Para evaluar el estado global de la fosforilación de tau en las muestras de proteína, un ensayo de fosfatasa fue descrito. Este ensayo se puede potencialmente utilizar para examinar el estado de fosforilación de alguna proteína.

Este ensayo se basa en el principio de que fosforila la proteína se mueve más lento …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue realizada como parte del proyecto titulado ‘Desarrollo y la industrialización de materia prima cosméticos de microalgas marinas de alto valor’, financiado por el Ministerio de océanos y pesquerías, Corea y fue apoyado por una subvención de intramuros (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de productos naturales.

Materials

HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X – 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C
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References

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Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).
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