Seguimiento en tiempo real de la separación de fragmentos de ADN por Smartphone
Summary
Los experimentos de electroforesis en gel de placas tradicionales (SGE) requieren un aparato complicado y un alto consumo de productos químicos. Este trabajo presenta un protocolo que describe un método de bajo costo para separar los fragmentos de ADN dentro de un corto período de tiempo.
Abstract
La electroforesis en gel de placas (SGE) es el método más común para la separación de fragmentos de ADN; Por lo tanto, se aplica ampliamente al campo de la biología y otros. Sin embargo, el protocolo SGE tradicional es bastante tedioso, y el experimento lleva mucho tiempo. Además, el consumo de químicos en experimentos SGE es muy alto. Este trabajo propone un método simple para la separación de fragmentos de ADN basados en un chip SGE. El chip está hecho por una máquina de grabado. Se utilizan dos láminas de plástico para las longitudes de onda de excitación y emisión de la señal óptica. La señal de fluorescencia de las bandas de ADN se recoge por teléfono inteligente. Para validar este método, se separaron escaleras de ADN de 50, 100 y 1.000 pb. Los resultados demuestran que una escala de ADN inferior a 5.000 pb puede ser resuelta en 12 minutos y con alta resolución cuando se utiliza este método, lo que indica que es un sustituto ideal para el método SGE tradicional.
Introduction
La electroforesis en gel de placas (SGE) es el método más eficaz para separar los fragmentos de ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 y por lo tanto se considera una herramienta versátil en los análisis bioquímicos y biológicos 6 , 7 , 8 . Sin embargo, muchos experimentos indican que SGE está restringido por los siguientes cuatro problemas: (1) las separaciones toman muchas horas, e incluso días; (2) el consumo de productos químicos es muy alto; (3) requiere un aparato complicado ( por ejemplo, célula de electroforesis 2D, fuente de alimentación de electroforesis y sistema de formación de imágenes de gel); (4) el sistema de formación de imágenes de gel sólo puede observar los fragmentos de ADN separados cuando se termina el experimento. Además, el bromuro de etidio (EtBr), que se utiliza comúnmente en SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, es mutagénico y cancerígeno 11 , 12 . Por lo tanto, siempre se deben usar guantes al entregar geles que contienen EtBr.
La electroforesis capilar (CE) tiene numerosas ventajas 13 , 14 , 15 , 16 , 17 en comparación con SGE, tales como funcionamiento automático, tiempo de separación corto y menor consumo. Sin embargo, el instrumento de la CE es bastante caro. Por lo tanto, para superar esas limitaciones, se ha desarrollado un sistema ( Figura 1 ) para la separación del ADN. Un sistema de este tipo no sólo puede reducir considerablemente el consumo de sustancias químicas y ahorrar tiempo de experimento SGE (<8 min), sino que también puede realizar un seguimiento en tiempo real del proceso de separación de ADN en el gel de agarosa por teléfono inteligente. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los estudiantes debenSer capaz de diseñar y fabricar el chip SGE, preparar el gel de agarosa en el chip, configurar un sencillo sistema SGE con un smartphone y registrar el proceso de migración de ADN en el gel de agarosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La electroforesis en gel de agarosa se emplea ampliamente para la separación de ADN, ARN y proteína. Este trabajo propone un nuevo método para reemplazar el tradicional protocolo de electroforesis en gel. Los resultados demuestran que las escaleras de ADN de 50, 100 y 1.000 pb se pueden separar bien en un dispositivo ensamblado de este tipo. La gran ventaja de este método es que no sólo puede separar los ácidos nucleicos con poco consumo químico, sino que también puede registrar el proceso de separación. Aunque…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 21205078) y el Fondo de Investigación para el Programa de Doctorado de Educación Superior de China (No.20123120110002). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de China (2016YFB1102303), el Programa Nacional de Investigación Básica de China (973Program; 2015CB352001) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
