Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays
Summary
Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.
Abstract
Post-translationele modificaties (PTM's) op histonproteïnen worden op grote schaal onderzocht voor hun rol bij het reguleren van chromatinestructuur en genexpressie. De massaproductie en distributie van antilichamen die specifiek zijn voor histone PTM's, hebben dit onderzoek op grote schaal vergemakkelijkt. Aangezien histon PTM-antilichamen belangrijke reagentia zijn voor veel chromatin-biochemie toepassingen, is een nauwkeurige analyse van antilichaamspecificiteit noodzakelijk voor nauwkeurige data-interpretatie en voortdurende vooruitgang op het gebied. Dit protocol beschrijft een geïntegreerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays voor het profileren van de specificiteit van histonantilichamen. De ontwerp en analyse aspecten van deze procedure worden vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source en interactief softwarepakket dat we onlangs ontwikkeld hebben om de aanpassing van microarrayformaten te stroomlijnen. Deze pijpleiding is gebruikt om een groot aantal commercieel verkrijgbare en veel gebruikte histone PTM antibodies te screenenS, en gegevens die gegenereerd worden uit deze experimenten zijn vrij beschikbaar via een online en expanderende Histone Antibody Specificity Database. Naast histonen kan de hierin beschreven algemene methodologie in grote mate toegepast worden op de analyse van PTM-specifieke antilichamen.
Introduction
Genomisch DNA wordt elegant verpakt in de eukaryote celkern met histonproteïnen om chromatine te vormen. De herhalende subeenheid van chromatine is het nucleosoom, dat bestaat uit 147 basisparen DNA die rond een octamerische kern van histonproteïnen – H2A, H2B, H3 en H4 1 worden gewikkeld. Chromatine is in ruime mate georganiseerd in losgekoppelde euchromatine en strak verpakte heterochromatin domeinen. De mate van chromatine compactie regelt de mate waarin eiwit machines kunnen toegang krijgen tot het onderliggende DNA om fundamentele DNA-templated processen zoals replicatie, transcriptie en reparatie uit te voeren.
Belangrijke regelgevers van de toegankelijkheid van genoom in het kader van chromatine zijn PTM's op de niet-gestructureerde staart- en kerndomeinen van histonproteïnen 2 , 3 . Histon PTM's functioneren direct door de structuur van chromatine 4 en indirecte invloed te beïnvloedenH de aanwerving van lezerproteïnen en hun bijbehorende macromoleculaire complexen die chromatine remodellerende, enzymatische en steigerwerk hebben 5 . Studies van histone PTM functie over de afgelopen twee decennia suggereren overweldigend deze markeringen spelen sleutelrollen bij het reguleren van celfate, organismeontwikkeling en ziekte-initiatie / progressie. Gevoed door de vooruitgang in de massaspectrometrie gebaseerde proteomische technologie, zijn meer dan 20 unieke histon PTM's op meer dan 80 verschillende histonenresiduen ontdekt 6 . In het bijzonder komen deze wijzigingen vaak voor bij combinaties, en in overeenstemming met de hypothese van de histoncodes, zijn tal van studies aan te geven dat lezerproteïnen gericht zijn op discrete gebieden van chromatine door herkenning van specifieke combinaties van histon PTMs 7 , 8 , 9 . Een belangrijke uitdaging voorwaarts is om functies toe te wijzen aan de grDoor een lijst van histon PTM's en om te bepalen hoe specifieke combinaties van histon PTM's de dynamische functies die geassocieerd zijn met chromatine orchestreeren.
Antilichamen zijn de lynchpin reagentia voor de detectie van histon PTMs. Als zodanig zijn meer dan 1000 histon PTM-specifieke antilichamen commercieel ontwikkeld voor toepassing in chromatin biochemieonderzoek. Met de snelle ontwikkeling van DNA-sequencing technologie met hoge doorstroming worden deze reagentia extensief gebruikt door individuele onderzoekers en grootschalige epigenomische "roadmap" -initiatieven ( bijv . ENCODE en BLUEPRINT) in ChIP-seq (chromatine immunoprecipitatie gekoppeld aan volgende generatie sequencing ) Pijpleidingen voor het genereren van hoge-resolutie ruimtelijke kaarten van histone PTM-distributie genoom-breed 10 , 11 . Echter, recente onderzoeken hebben aangetoond dat de specificiteit van histon PTM antilichamen zeer sterk kan zijn en dat deze reagentia onbeschikbaar zijn Waardevolle epitoopherkenning, sterke positieve en negatieve invloed van naburige PTM's en moeilijkheden om de modificatieorde op een bepaald residu te discrimineren ( bijvoorbeeld mono-, di- of tri-methyllysine) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Daarom is strenge kwaliteitscontrole van histon PTM-specifieke antilichaamreagentia nodig om de gegenereerde gegevens met deze waardevolle reagentia nauwkeurig te interpreteren.
Microarray technologie zorgt voor gelijktijdige ondervraging van duizenden macromoleculaire interacties in een high-throughput, reproduceerbare en miniatuurformaat. Om deze reden zijn een verscheidenheid aan microarray platforms gecreëerd om eiwit-DNA 19 te analyseren ,"> 20, eiwit-eiwit 21 en eiwit-peptide interacties 22. Inderdaad, histone peptide microarrays zijn opgevat als een informatief ontdekkingsplatform voor chromatin biochemie onderzoek, waardoor high-performance profielen van de schrijvers, wisers en lezers van histone PTMs 15 mogelijk zijn. , 23, 24, en tevens voor de analyse van histon antilichaamspecificiteit 17, 25. Naast hun toepassing in chromatine en epigenetica onderzoek histonpeptide arrays potentiële bruikbaarheid als een diagnostische / prognostische test voor systemische lupus erythematosus en andere auto-immuun ziekten waarbij anti- Chromatine auto-antilichamen worden gegenereerd 26 , 27 .
Hier beschrijven we een geïntegreerde pijpleiding die we hebben ontwikkeld voor het ontwerpen, fabriceren en queHistone peptide microarrays rijst om specificiteitsprofielen te genereren voor antilichamen die histonen en hun PTM's herkennen. De pijplijn wordt vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source, interactieve software applicatie die we onlangs hebben ontwikkeld, die de ontwerp- en analysestadia van microarray-experimenten 28 integreren. ArrayNinja werkt het best in Google Chrome. In het kort wordt een robot-contact microarray printer gebruikt om een bibliotheek van biotine-geconjugeerde histonpeptiden te deponeren op bepaalde posities op streptavidine-beklede glasmicroscoopschuiven. Arrays kunnen dan in een competitief en parallel assayformaat gebruikt worden om antilichaam-epitoopinteracties te ondervragen ( Figuur 1 ). De peptidebibliotheek bestaat uit honderden unieke synthetische peptiden die PTM's bevatten (lysine acetylering, lysine / arginine methylering en serine / threonine fosforylering) en in relevante combinaties die grotendeels afkomstig zijn uit proteomische datasets. Methoden voor peptidsynthese en validatie Zijn elders gedetailleerd beschreven 23 . Gegevens die worden gegenereerd uit onze lopende histone PTM antilichaam screening inspanningen gebruik maken van dit array platform worden gearchiveerd op een openbare web resource, de Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Met name zijn histonepeptidemicroarrays die zijn vervaardigd met variaties van dit protocol, uitgebreid gebruikt om de activiteit van histone PTM-lezer domeinen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 en meer recentelijk te profileren histone PTM-schrijver- en gumwerkactiviteiten 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figuur 1: Beeldvertoning van de stapse procedure voor het screenen van antilichamen op een microfoon van een histonpeptide. Biotinyleerde histonpeptiden die gedefinieerde post-translationele modificaties (rode en blauwe cirkels) bevatten, worden geco-gedrukt met biotine-fluoresceïne op streptavidine-gecoat glas. Positieve interacties worden weergegeven als rode fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De betrouwbaarheid van antilichamen in biomedische onderzoekstoepassingen is voornaamste 46 , 47 . Dit geldt met name in chromatin biochemie gezien de positie van antilichamen als belangrijke instrumenten voor de meerderheid van de technieken ontwikkeld om de overvloed en verdeling van histon PTMs te karakteriseren. Het protocol presenteerde hier details een geoptimaliseerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays om de histon …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Van Andel Research Institute en een onderzoeksbijdrage van de National Institutes of Health (CA181343) naar SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
References
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
