Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Polimerler, α – ve β-birkaç hangi içi boş boru^1,2oluşturmak üzere birleştirmek doğrusal protofilaments araya tübülin mikrotübüller (MTs) vardır. MTs biter hızla büyüyen ve yavaş-centrosome veya diğer Mikrotubul düzenleme Merkezi (MTOC)³bağlantılı biter eksi büyüyen polarize, yapılardır. De novo MT oluşumu, γ-tübülin yüzük karmaşık çekirdekleşme (γ-TURC), MT derleme⁴için bir şablon sağlayan tarafından başlatılır. Verilen herhangi bir hücresinde, MTS iki popülasyonun o dönüşü üzerinde farklı oranlarda ayrılır. Dinamik MTs büyüme aşamaları ve büzülme dinamik istikrarsızlık⁵olarak bilinen bir işlemle arasında geçiş yaparak onların hücresel ortamı keşfetmek. Dinamik MTs, aksine istikrarlı MTs sigara büyüyen ve dinamik MTs⁶‘ dan daha uzun bir yarı ömrü vardır.

Araştırmalar yılların MT yapısı ve fonksiyonu çalışma araçları karmaşık bir dizi sağlanan ve hücre iskeleti bu öğeler üzerinde bilgi büyük bir vücut sonuçlandı. Örneğin, MTs kurulması ve aynı zamanda kararlı dinamik MTs^7, karşı farklı hücre altı dağıtım için kendi içsel polarite sadece atfedilebilecek hücre polarite bakım merkezi bir rol oynamaktadır ⁸. buna ek olarak, çok daha az MT mimarisi ve işlev omurgalı embriyo gibi daha karmaşık üç boyutlu (3-D) ortamlarında hakkında kısmen nedeniyle MT sitoiskeleti yüksek çözünürlükte görüntüleme meydan anlaşılmaktadır. Bu sınırlamaya rağmen GFP-ifade transgenik son nesil bu etiketle MTs hatları veya geçici ifade fluorescently öğesini MT işaretlerinin MTs geçmesi dinamik değişiklikleri ve onların hücresel anlayışımızı artmıştır ve Zebra balığı embriyo gelişimsel rolünde. Tüm MT ağ hangi tübülin transgenik satırlarında etiketli⁹ veya tübülin polimerler MT ilişkili proteinler kullanarak dolaylı olarak etiketlenir doğrudan olması yansıması Doublecortin-gibi-kinaz (Dclk) veya Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Diğer çizgiler (ve yapıları) MT içsel polarite değerlendirilmesi özellikle MT artı biter etiketleme tarafından etkinleştirmeniz veya biter^11,12,13, centrosome bağlantılı oluşturulan ¹⁴. organizmalar geliştirme yeteneği MT dinamiklerini canlı, çalışma için bu araçları gücü yatıyor. Bu tür çalışmalar, örneğin, MTs kayma ve dinamik dağıtım, belirli hücre popülasyonlarının indirdik, Mitotik yönünü morfogenez (hücre bölünmesi boyutunda bir gösterge) geçiren dokularda MT polimer polarite spindles hücre uzama ve geçiş, gibi işlemleri ile ilişkisini ve MT büyüme hızı kuyruklu yıldız hız^9,13,15tarafından belirlenir. Bu araçların onlar kolayca istikrarlı ve dinamik MT nüfus arasında ayırımcılık değil ki kısıtlamadır.

Zengin hücre biyolojisi edebiyatından çizim, Zebra balığı embriyo istikrarlı ve dinamik MTs görüntüye immunolabeling yöntemleri burada, transgenik çizgiler kullanmak için tamamlayıcı olduğu açıklanmıştır. Zebra balığı böyle immunolabeling yöntemleri yaygın kullanımı biraz zorluk fiksasyon işlemi sırasında MT bütünlüğünün korunmasında engel olmuştur. İmmunolabeling toplam, dinamik, için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi protokol 1 özetliyor ve istikrarlı MTs gelişmekte olan Zebra balığı arka beyin bölümlerini çapraz. Ayrıca, ticari olarak kullanarak basit bir yöntem bu MT nüfus ölçmek için kullanılabilir yazılım açıklanmıştır. İstikrarlı MTs dinamik MTs α-tübülin, istikrarlı MTs saat^16,17üzerinde birikir asetilasyon ve detyrosination, gibi çeşitli translasyonel modifikasyonlar dayalı dan ayırt edilirler. Zebra balığı embriyo asetilasyon silier ve aksonal MTs ama bu işaretleyici bir alt kümesi stabilize MTs ile kullanışlılığı sınırlama değil istikrarlı Interphase MTs¹⁸, oluşur. Buna ek olarak, Zebra balığı embriyo¹⁸tüm istikrarlı MTs oluştuğu detyrosination görünür. Bu translasyonel modifikasyon carboxy-terminal glutamik asit α-tübülin (detyrosinated tübülin)¹⁸ ortaya çıkaran ve anti-Glu-tübülin¹⁹kullanarak tespit edilebilir. Detyrosination tercihen istikrarlı MTs üzerinde oluşmakla birlikte, deneysel kanıtlar bu translasyonel modifikasyon bir nedeninin, MT istikrar¹⁶yerine bir sonucu olduğunu gösterir. Dinamik MTs oluşan karşılıklı MT nüfus bir antikor, anti-Tyr-bu özellikle α-tübülin¹⁹tyrosinated şeklinde tanır tübülin, kullanarak ayırt edilir. Bu işaretleri ve confocal görüntüleme immunolabeling gelişen Nöral tüp tanımlanan bölgelerde MTs (uzunluk, numarası ve göreli bereket) kantitatif analiz gerçekleştirilebilir. Akıcı bir yöntem 3 boyutlu görüntü işleme yazılımı kullanarak bu analiz gerçekleştirmek için buraya sağlanır. Bu yöntem morfogenez ve kuruluş veya hücre polarite²⁰olgunlaşma ile ilgili soruları için uygulanabilir. Gerçekten de, istikrarlı MTs polarize dizileri hazırlama photoreceptor morfogenetik²¹, epithelialization gelişmekte olan Nöral tüp¹⁸ ve akson oluşumu⁸hücre de dahil olmak üzere birçok gelişimsel olay eşlik eder.

Protokolü 2 vivo uyarlaması MTs onların derleme aşaması (çekirdekleşme/çapalama ve büyümesi)^22,23sırasında analiz etmek için bir hücre biyolojisi tahlil açıklar. Yeni doğmakta olan MTs parçalanmayabilir centrosome ve daha sonra anne centriole²³subdistal uzantıları için bağlantılı. Yeni doğmakta olan MT büyütme bozulumu takip analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Bu iletişim kuralı, MTs, uyuşturucu Silinerek geçiş prosedürü ve tedavi sonrası iyileşme döneminde depolymerize için nocodazole tedavi için ayrıntıları sağlar. MT yeniden büyüme düzenli aralıklarla izlenirs yazı Silinerek geçiş işaretli toplam MTs için immunolabeling tarafından (anti β-tübülin) yanında centrosome için işaretleri (anti γ-tübülin) ve çekirdek (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), iletişim kuralı 1‘ de açıklanan genel yordamlara göre belirleme yapılacağı. MT bozulumu adım bu protokol değerlendirme de novo MT büyüme yerine önceden varolan MTs uzantısı sağlar, gerekli. Bu tekniği bu nedenle bağlayıcı protein 3 Tran ve ark.içinde gösterildiği gibi yeşil flüoresan protein (EB3-GFP), erimiş bağlıdır son gibi artı bir ipucu işaretleyici kullanarak (bozulumu yokluğunda) MT büyüme oranları ölçmek için yayımlanmış diğer yordamlar ayrıdır, 2012¹¹. Ayrıca, bu tahlil embriyo de novo MT derlemede arızalı analiz etmek için özellikle yararlıdır γ-tübülin centrosome için alımı Engelli daha önce bildirilen NEDD1 mutantlar gibi içinde eksik çıkan Nöral tüp oluşumu ve nöronal kusurları²⁴.