卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病^1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。

今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった（2002）私（2003）。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル（受精から離乳までの6週間）、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色（交差戦略に必要）などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました³ 。

遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の⁴年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした⁴ 。しかし、研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。

このような制限の1つは、Gordon et al。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています⁷ 。マイクロインジェクションは、導入遺伝子の組み込み部位（最終的に各創始マウスの特異的発現レベルをもたらす）の制御を可能にしないが、前核ミクロインジェクションの主な利点は、コンカテマー（ すなわち、トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。

Mario Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました⁸ 。しかし、ES細胞の培養、キメラの程度の変化、およびプロセスの長さ（ すなわち、マウスを得るために最小12〜18ヶ月）を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。

最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、および規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列（CRISPR / Cas9）のような工学エンドヌクレアーゼのような新技術の進歩が、マイクで遺伝子ターゲティングのプロセスを加速するe ^9,10 。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。

ゲノム編集^11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた（「多重化"）。 CRISPRは、マウス^12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている^13,14 。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。

トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。この技術は我々 ¹⁵およびその他¹⁶によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。