Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

Lo spazio extracellulare (ECS) è la rete di canali interconnessi esterni a tutte le cellule del cervello e contiene sia il liquido interstiziale che la matrice extracellulare ( Figura 1a e Figura 1b ). La distribuzione di molte sostanze necessarie per la funzionalità delle cellule cerebrali, comprese le sostanze nutritive, gli ormoni e i neurotrasmettitori, avviene per diffusione attraverso la ECS. I cambiamenti nei parametri fisici di questo spazio, compresi il volume, la geometria e la matrice extracellulare, possono influenzare drasticamente la diffusione attraverso la ECS e le cellule cerebrali di concentrazione delle ioni locali che hanno un impatto profondo sulla funzione delle cellule cerebrali ^{1 , 2} .

La iontoforesi in tempo reale (RTI) è utilizzata per determinare due caratteristiche strutturali di una regione del cervello: frazione di volume e tortuosità ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. La frazione di volume ( α ) è la proporzione del volume tissutale occupato dall'ECS ( V _ECS ) rispetto al volume totale del tessuto ( _tessuto V ) in un volume elementare rappresentativo;

La tortuosità ( λ ) è l'impedenza relativa che una sostanza incontra quando diffonde attraverso una regione del cervello rispetto ad un mezzo senza ostruzioni;

Dove D ^* (cm ² s ^-1 ) è il efficace coefficiente di diffusione della sostanza nel cervello e D (cm ² s ^-1 ) è il coefficiente di diffusione libera della sostanza in un mezzo libero, come il gel agarosio diluito.

Oggi, la sostanza sonda più comunemente utilizzata per la RIl metodo TI è il piccolo cation tetrametilammonio (TMA). TMA ha un peso molecolare di 74 g / mol, si dissociizza completamente in soluzione e ha una carica positiva. Gli studi di RTI con questo ione hanno dimostrato che α 0,2 e λ 1,6 ^{1 , 2} . Ciò significa che l'ECS è circa il 20% del volume totale del cervello e che la diffusione di una piccola molecola inerte si verifica circa 2,5 volte più lentamente nella ECS che in un mezzo senza ostruzioni ³ . Tuttavia, entrambi α e λ variano con l'età del cervello, la regione e lo stato e nelle condizioni patologiche ¹ . Le alterazioni di questi parametri sono state legate allo sviluppo del cervello, all'invecchiamento, al sonno, all'epilessia e ad altri processi fondamentali e alle malattie del cervello ^{1, 6} . Mentre altre tecniche misurano α e λ , RTI può misurare sia in regioni localizzate del tessuto vivente in tempo reale. Per questa ragione, RTI è diventato uno strumento indispensabile per indagare i cambiamenti in α e λ durante le sfide acute e reversibili.

La teoria che supporta RTI è stata originariamente convalidata da Nicholson e Phillips, e la tecnica è stata ampiamente usata da quel tempo ^{4 , 7} . Gli esperimenti che impiegano RTI iniziano con il rilascio di un impulso di TMA da un microelettrodo di origine mediante iontoforesi in un gel agaroso diluito. Una volta espulsi, gli ioni si diffondono liberamente dalla sorgente di punti, scegliendo da un numero potenzialmente infinito di percorsi casuali ( Figura 1d ). La variabile concentrazione dello ione viene misurata nel tempo utilizzando un microelettrodo ionico-selettivo (ISM) posizionato approssimativamente100 μm di distanza ( figura 1c ). Le variazioni della concentrazione TMA sono grafiche e montate su una curva che permette di calcolare sia il D che il numero di trasporto del microelettrodo ionoforesi (parametri discussi nel Protocollo). Con questi valori, la procedura viene ripetuta in una regione cerebrale di interesse per ottenere D ^* e per calcolare sia α che λ . Il controllo del microelettrodo ionoforesi, la raccolta dei dati, la grafica e l'adattamento della curva di concentrazione TMA e il calcolo dei parametri sperimentali sono tutti tipicamente eseguiti dai programmi Wanda e Walter, che sono stati appositamente progettati per questo scopo (il software ei relativi manuali sono Liberamente disponibile dagli autori su richiesta).

La sezione del protocollo di questa rassegna descrive le procedure di base necessarie per progettare e eseguire RTI nelle fette del cervello di roditore. La tecnica è stata usata anche in non-astaTra cui le fette del cervello umano e le preparazioni cerebrali in vivo ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . La sezione Risultati rappresentativi fornisce sia risultati ideali che non ideali per evidenziare le sfumature nell'interpretazione dei dati. Infine, la sezione Discussione riguarda brevemente tecniche di risoluzione dei problemi, limitazioni di RTI, tecniche alternative utilizzate per studiare l'ECS e future applicazioni di RTI.

Figura 1: Diagrammi di diffusione tramite ECS. (A) Schema di ECS: dimostra la dimensione e la posizione della ECS in una sezione tipica del cervello. Il colore giallo contrassegna l'ECS tra i processi grigi della cervello. Il volume della ECS è circa il 20% del volume totale del tessuto ( cioè, frazione volume = 0.2) in condizioni fisiologiche. ( B ) Schema ingrandito della ECS: evidenzia i parametri fisici che contribuiscono alla tortuosità, compresa la geometria delle cellule cerebrali (grigio) e la matrice extracellulare (schematizzata come una mesh di glicosaminoglicani multicolori e proteoglicani). ( C ) Diagramma 3D della diffusione da una sorgente di punti: dimostra il movimento netto delle molecole inerte da una sorgente ionoforoica ad un ISM. Escludendo le barriere di diffusione e l'assorbimento cellulare le molecole si diffondono verso l'esterno in tutte le direzioni, producendo una parte frontale di concentrazione sferica. L'ISM quantifica la concentrazione locale delle molecole inerte rilasciate dalla fonte iontoforica. ( D ) Simulazione computerizzata della diffusione in ECS del cervello: [Fine a sinistra] Impostazione per la simulazione di Monte Carlo; Le sfere verdi rappresentano i processi delle cellule cerebrali e la croce rossa rappresenta una fonte di punti. Questa impostazione modella il tessuto cerebrale disegnato in Figura 1a . [Immagini medie] 3 e6 molecole che eseguono movimenti casuali in quanto diffondono attraverso lo spazio extracellulare del cervello, mostrato in 2 dimensioni. [Estrema destra] Camminate casuali di molte molecole rilasciate dalla sorgente di punti. Il movimento netto di tutte le molecole dalla sorgente di punti è verso l'esterno come mostrato nella Figura 1c . Le passeggiate casuali cumulative delineano gli spazi tra le celle ( cioè l'ECS; vedere il riferimento ⁵ per ulteriori spiegazioni). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.