Kemirgen nöromusküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant Adeno ilişkili virüs serotip 9 kullanarak mikroRNA sistemik teslim
Summary
Burada bir rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 9 nöromuskuler hastalık bir fare model kullanma mikroRNA teslimini açıklayın. Sürekli miRNA overexpression kas ve motor nöronlar, bir fırsat çalışma miRNA işlevi ve tedavi edici potansiyel içinde vivosağlayan bir tek çevresel yönetim farelerde sonuçlandı.
Abstract
RNA müdahale endojen miRNA yolu üzerinden çoğu gen susturmak yoluyla protein sentezini kontrol ederek gen ekspresyonu düzenlemektedir. Son yıllarda miRNA-aracılı gen düzenlemesi işlev mekanizması toksik bir kazanç tarafından neden sinir hastalıkları tedavisi için potansiyel göstermiştir. Ancak, hedef dokulara verimli bir şekilde teslim uygulama sınırlıdır. Burada omurilik ve bulber kas atrofisi için (KALAKLAN) bir transgenik fare modeli kullanılan, nöromüsküler bir hastalık polyglutamine genişleme androjen reseptör (AR) Gen tarafından susturulması test etmek için yeni bir tespit AR hedefleme miRNA, miR-298 neden oldu. MiR-298 rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip 9 vektör iletim hücre bölünmesi kolaylaştırmak için kullanarak overexpressed. Tek bir kuyruk-damar enjeksiyon KALAKLAN farelerde sürekli ve yaygın overexpression miR-298 kas iskelet ve motor nöronlar ile indüklenen ve farelerde nöromüsküler fenotip iyileşme sonuçlandı.
Introduction
MiRNAs RNA’ların, Gen ifadesinin düzenlenmesi ve çeşitli hücresel ve metabolik yollar kontrol önemli bir rol oynamaktadır 21-23 nükleotid uzunluğunda, kodlamayan. 1 gen ekspresyonu esas olarak çoğu gen susturmak veya mRNA yıkımı inducing tarafından düzenlenir. 2 MiRNAs genellikle 5′ UTR bağlama rağmen genler, kodlama ve Kodlayıcı bölgeler mRNA’da açıklanan hedef için 3′ çevrilmeyen bölgesi (UTR) tamamlayıcı niteliktedir. 3
MiRNA insan hastalıkların patogenezinde rol geçerli anlayışı yaygınlaştıkça, bireysel miRNAs veya miRNA aileler farmakolojik modülasyon giderek uygun bir tedavi seçeneği haline geliyor. Diğer RNA inhibisyon stratejileri için karşılaştırıldığında, miRNAs pek çok avantajı var: miRNAs daha az toksik ve daha az immunojenik ve kolayca hücrelere küçük boyutlarından dolayı teslim edilebilir. 4 , 5 , 6 MiRNAs genellikle hücresel ağları içerisinde birçok hedefleri bu nedenle potansiyel hedef kapalı efektleri ve verimli bir şekilde teslim hedef dokulara birlikte dikkate alınması gereken güvenlik endişeleri var.
Nöromüsküler hastalıklar iktisap veya kas ve motor nöronlar etkileyen koşullar miras. Kas iskelet ilaçlara hedefleme nerede tedavi penceresi içinde yaygın dağıtım elde etmek için büyük zorluk olduğunu ortaya çıkan araştırma, alanıdır. 7 ilaç erişim kan beyin bariyerini tarafından ağırlıklı olarak durdurulmasını emretti çünkü Motor nöronlar hedeflemek, daha zordur.
Hücre kültür ve fare modelleri omurilik ve bulber kas atrofisi (KALAKLAN) Bu çalışmada kullanılmıştır. KALAKLAN işlev mekanizması, kas ve motor nöronlar etkilenen toksik bir kazanç tarafından neden nöromüsküler bir hastalıktır. 8 , 9 KALAKLAN (Kennedy’nin hastalığı; OMIM #313200) bir kas güçsüzlüğü tarafından karakterize hastalik, X’e bağlı ve atrofi, bir genişletilmiş polyglutamine yolu AR protein kodlar AR gen CAG tekrar genişleme nedeniyle. 10 hastalığı değiştirme tedavisi yok Bu bozukluk için şu anda mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan transgenik fare modeli özellikleri cinsiyet özgüllük, motor nöron patoloji ve ilerleyici kas atrofi gibi hastalığın beyannamedir. 11
Bu çalışmada, çabalarımızı odaklı bir miRNA belirlenmesi üzerinde doğrudan downregulates ifade mutant AR transgene ve bir güvenli ve etkin modu miRNA omurilik için ve bizim hastalık fare modeli kas iskelet tasarımı.
Burada biz bir nispeten uncharacterized miRNA, miRNA-298 (katılım numarası MIMAT0004901), doğrudan mutant AR ifade KALAKLAN modellerinde azaltmak için12 tespit. MiR-298 teslimini hedef dokulara elde etmek için biz viral strateji, rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 9 (rAAV9) ile kullanılır. rAAV9 kan beyin bariyerini geçiş ve uzun vadeli gen ekspresyonu hücrelerdeki nöronlar dahil olmayan bölme, arabuluculuk yeteneğine sahiptir. 13 AAV9-miR-298, tek bir sistemik yönetimi miRNA, kas ve motor nöronlar etkili iletim, aşağı-AR ifade Yönetmeliği ve hastalık fenotip KALAKLAN farelerde iyileşme sürekli ifade sonuçlandı. 14 Bu metodoloji miRNA veya antagomirs overexpression vivosağlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada seçin ve rAAV9 kas iskelet ve motor nöronlar farelerde hedeflemek için viral vektör olarak kullanarak bir miRNA kuyruk enjeksiyon yolu ile teslim için son derece verimli ve erişilebilir bir metodoloji göstermektedir. 14 diğer RNAi stratejileri, miRNAs daha az toksik ve daha az immünojenik karşılaştırılır. 18 Ayrıca, onları iyi viral vektörler sınırlı paketleme kapasitesine uygun yapmak onların küçük büyüklük. 2 sözde miRNA-mRNA hedefleri tanımlaması hesaplama algoritmaları ve tahmin araçları sağlar. Bir kez tespit, hedef gen ekspresyonu miRNA etkilerini kontrol edilmelidir. Ortak bir yaklaşım verilen miRNA vitro overexpress ve hedef protein ifade düzeyleri Batı analizi ile tespit etmektir. 14 , 19
Çeşitli çalışmalar viral ve non-viral stratejiler miRNAs teslim etmek için kullandık. 13 burada biz adeno ilişkili virüs (AAV) bir gen teslim aracı olarak kullandı. Diğer viral vektörler için karşılaştırıldığında, AAV aydınlığa çıkartıyor düşük immünojenisite, uzun vadeli gen transferi sağlar ve tropism bölme içinde geniş bir yelpazede sahiptir ve hücreleri olmayan bölme. 18 bu teslim yöntemi işlevsellik ve özgüllük RNA molekülünün etkileyebilecek kimyasal değişiklik ihtiyacını da değiştirebilir. Çoğunlukla kapsid protein bileşimi tarafından belirlenir, AAV, birkaç serotipi vardır. Bu serotipleri ve onların tropism farklı farklı hücre tipleri transduce. Hedef doku göz önünde bulundurarak doğru serotip seçmek gereklidir. Biz rAAV9, merkezi sinir sistemi ve çevresel yönetim19,20aşağıdaki iskelet kası yüksek iletim verimliliği nedeniyle seçildi. Bu yaklaşım daha fazla iletim etkinliği Yetişkin hayvanlar, hücre dışı matriks kompozisyon, nöron glia oranı ve kan-beyin bariyerini olgunluk farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla göre neonatal hayvanlarda göstermiştir. 21 , 22
Bu iletişim kuralı konusunda önemli bir adım ifade vektör tasarımıdır. İkinci gen düzenleyici yanındaki ilk gen ile karşılaştırıldığında daha düşük ifade tarafından engel vardır, bicistronic vektörler ile karşılaştırıldığında çift organizatörü vektör miRNA ve EGFP, yüksek ifadesi böylece verimli bir arka arkaya yapılandırma sağlar miRNA yerelleştirilmesini fare dokusunda ayirt tarafından izin.
AAV9 İntravenöz enjeksiyon yüksek verimli ve homojen iletim hedef dokulara, iskelet kası ve motor nöronlar sonuçlandı. Bu rota enjeksiyon sistemik dolaşım ulaşmak ve merkezi sinir sistemi hedefleme tedaviler için önemlidir beyin kan bariyerini çapraz yönetilen doz sağlar. Ayrıca, teslim edilmek üzere MSS non-invaziv bir yöntemdir. MiR-298 ifade 5 hafta-in yaş, tek bir periferik enjeksiyon ile 2-4 hafta sonra spinal kord ve kas arttı. Otelde tek iplikçikli genom AAV vektörel çizimler, ikinci DNA zinciri de novo sentezi kullanarak gecikmeli iletim için sorumlu olabilir. 23
İnsan miR-298 düzeyde kronik hastalıklar için birden fazla enjeksiyonları bir terapötik yarar ulaşmak için gerekli olabilir düşündüren bir tek yönetim sonra 20 hafta tedavi farelerde tespit edilemez. Bir ömür boyu yinelenen yönetim gerekli olduğunda ancak, zaman içinde miRNA bozulması sınırlayıcı. Buna ek olarak, edinilmiş bağışıklığın AAV vektörel çizimler için başarılı gen teslim başka bir engel oluşturabilir. 24 immunologically etkisiz AAV vektörel çizimler nesil böylece yinelenen yönetim ve gelecek vaat eden bu iletim sistemi ile uzun vadeli etkileri ulaşmak için çok önemlidir. 25
Bir kullanımı miRNA bir tedavi stratejisi olarak hedef kapalı etkileri risk kısıtlamasıdır. MiRNAs aracılığıyla incomplementary baz eşleşmesi diğer gen tutanaklar ile hangi bir güvenlik riski bu yaklaşım ile etkileşime girebilir. Kanonik olmayan miRNAs, mirtrons gibi kullanımı dahil RNAi dizilerinin tasarımı hangi mikro işlemci karmaşık atlamak ve geliştirilmiş geniş uzun vadeli güvenlik ve tolerabilite çalışmalar kritik bir kasa bu strateji tercüme önce ve etkili tedavi. 26 , 27 , 28
Burada anlatılan yöntem aslında miRNA overexpression için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda antagomirs kullanarak miRNA inhibisyon tedavisi için yararlı olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim. SignaGen Laboratuvarları (Rockvile, MD, ABD) AAV9 virüs üretimi için teşekkür ederiz. Bu araştırma NINDS, NIH Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Philip R. Lee NICHD Intramural araştırma bölümü fonlarından desteklenen bir durumdu. Carlo Rinaldi Derneği Française contre les Myopathies (AFM) bir bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
| snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
| miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
| Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
| Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
| mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
| AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |
References
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
- Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5′ untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
- Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
- Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
- Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
- Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
- Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
- Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
- La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
- Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
- Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
- Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
- Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
- Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk–database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
- Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
- Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
- Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).
- Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Wang, Z., Ma, H. -. I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
- Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
- Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
- Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson’s disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).
