Induction de l'hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

La recherche sur l'hypoxie comporte de nombreuses applications. Il s'agit notamment d'enquêter sur la pathogenèse et de développer des traitements pour les affections médicales caractérisées par une hypoxie ¹ et une maladie aiguë de haute altitude ² . Le stress hypoxique entraîne des changements métaboliques majeurs chez tous les organismes nécessitant de l'oxygène. Le stress hypoxique influence également la croissance et le développement du fœtus et la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, y compris la restriction de la croissance intra-utérine ³ . Le stress hypoxique peut non seulement entraîner une réduction du poids à la naissance, la mortalité du foetus et du néonatale, mais aussi entraîner de nombreuses complications dans la vie adulte, telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, l'obésité et l'hypertension ⁴ . Le stress hypoxique est également souvent observé lors du développement de la tumeur solide, lorsque le tissu tumoral dépasse son apport sanguin. Il est donc crucial de pouvoir étudier les effets de l'hypoxie in vivo et directement pendant l'embryon Développement yonique.

Parmi les méthodes les plus connues qui ont été utilisées pour étudier les effets de l'hypoxie au cours du développement, il y a l'utilisation de chlorure de cobalt dans le milieu de croissance ou l'incubation de l'organisme dans une chambre hypoxique. Le chlorure de cobalt induit artificiellement une réponse hypoxique sous une concentration normale d'oxygène, en raison de son rôle dans la stabilisation du facteur 1 inducible par l'hypoxie (HIF-1α) en empêchant sa dégradation protéosomale ^{5 , 6 , 7} . Cependant, étant une méthode pratique ⁸ , l'utilisation de chlorure de cobalt ainsi que d'autres mimétiques d'hypoxie chimique similaires peut avoir un effet délétère non spécifique sur les cellules et les tissus, par exemple , l'apoptose ⁹ . Par conséquent, les chambres hypoxiques sont une meilleure méthode pour l'induction de «l'hypoxie naturelle» dans les organismes vivants au cours du développement normal.

Nous nous sommes concentrés sur le développement d'un système d'induction de l'hypoxie chez les embryons d'animaux aquatiques. Les grenouilles et le poisson zèbre sont devenus des organismes modèles informatifs à base de vertébrés pour des études sur de nombreux processus biologiques, ainsi que des modèles pour diverses maladies humaines. Se développent à l'extérieur, éliminant la complication de la compensation maternelle. En outre, un développement rapide permet de manipuler les facteurs environnementaux et d'observer les changements phénotypiques dans la formation des organes en temps réel. En outre, de nombreux composants des voies principales de transduction du signal sont fortement conservés Ces organismes modèles et ont été caractérisés en détail par une large littérature. Le principal avantage de l'utilisation de grenouilles et d'embryons de poissons zèbres pour étudier les effets de l'hypoxie sur le développement des vertébrés est que tous les processus peuvent être surveillés directement, car l'oxygène pénètre rapidement dans les embryons. Ainsi, dans les grenouilles et le poisson zèbre, contrairement aux autres organismes modèles tels queEmbryons de souris, l'influence d'une concentration d'oxygène spécifique peut être étudiée dans le tissu d'intérêt, sans tenir compte de la présence ou du manque de système vasculaire fonctionnel.

La plupart des configurations disponibles dans le commerce pour l'incubation hypoxique présentent l'inconvénient d'être relativement importantes et d'avoir des coûts de fonctionnement élevés. Outre leur coût initial élevé et leur consommation de gaz, l'équilibrage et l'entretien des chambres communes d'hypoxie nécessitent un maintien de l'atmosphère hypoxique constante contre le gradient de gaz qui se produit naturellement dans ces chambres en raison de leur plus grande taille et / ou de leur respiration. Cela nécessite l'emploi de ventilateurs à gaz et un système de refroidissement, ce qui augmente la quantité d'équipement nécessaire supplémentaire, entrave la dextérité du chercheur et diminue globalement la simplicité de la procédure expérimentale. En revanche, la configuration que nous présentons ici est relativement robuste mais très rentable, petite, facile à établir et permet fÉquilibre économique des gaz, atmosphère hypoxique stable et échange simple de matériaux et de solutions dans la chambre. Notre système peut être utilisé pour être utilisé avec n'importe quel organisme modèle aquatique d'intérêt.

Nous avons construit une chambre hypoxique qui est commodément petite et donc peut être placée dans un incubateur de laboratoire commun, ce qui permet facilement des procédures expérimentales à n'importe quelle température spécifique. Offrant un contrôle pratique de la température ainsi que de la concentration d'oxygène dans le milieu, l'avantage de notre système contre les incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce réside dans sa petite taille et son rapport coût-efficacité. Ainsi, notre configuration peut être établie en utilisant des fournitures de laboratoire générales disponibles pour la majorité des laboratoires de recherche et ne nécessite aucun matériau coûteux. En outre, notre installation ne génère pas de chaleur, contrairement aux incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce, et permet une utilisation à des températures inférieures à la température ambiante placées dans un incubateur. La laSt est particulièrement critique pour le travail avec des organismes à sang froid tels que les grenouilles et les poissons où les taux de développement et métabolisme dépendent fortement de la température.

Étant très rentable et facilement construit, notre chambre d'incubation de gaz est néanmoins très polyvalente dans l'établissement de diverses conditions hypoxiques ou hyperoxiques, tout en permettant une administration rapide et facile de différents supports et solutions pour un grand nombre de conditions expérimentales. En outre, en utilisant une plaque de 24 puits au lieu des plats couramment utilisés ou des réservoirs de laboratoire ^{10 , 11 , 12} , notre système permet l'observation et le traitement expérimental de plusieurs conditions mutantes à la fois.

Pour contrôler l'induction correcte de l'hypoxie, nous avons surveillé les niveaux de la protéine HIF-1α par détection Western Blot. En outre, le nombre de cellules proliférantes avant et après incubationN dans la chambre hypoxique peut être utilisé pour déterminer si l'hypoxie a été induite dans le tissu. Cette méthode est basée sur nos résultats précédemment publiés ¹³ , montrant que la prolifération du nerf embryonnaire de cellules souches rétiniennes diminue lors de l'induction de l'hypoxie. Ainsi, nous avons surveillé le niveau de prolifération des cellules souches de la rétine en ajoutant de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) au milieu embryonnaire et en mesurant son incorporation dans l'ADN des cellules nouvellement proliférantes.