将人诱导的多能干细胞分化为神经元和神经胶质的混合培养物进行神经毒性测试的方案

人诱导多能干细胞（hiPSC）扩增注意：在含有mTeSR1 5x补充剂的mTeSR1培养基（根据制造商的说明书制备;板〜100个菌落片段/ 60-mm培养皿）的存在下，hiPSC可以在合适的蛋白质混合基质上培养。当hiPSC菌落达到合适的大小（参见图2A中的菌落实例）时，如下所述（每周一次）传代细胞。 用hESC合格的基底膜基质（以下称为“合格基质”）或任何其他合适的蛋白质底物涂层。 在冷的1.5 mL试管和冷的5 mL或10 mL移液管中，将合格的基质（见材料表）存放在-80°C的200μL等分试样中。 在传代之前，在冰上解冻200μL合格的基质。 在20 m稀释200μL合格基质L的DMEM / F12培养基（1:100稀释）。 用该溶液（5mL /皿）涂上60mm培养皿。 将包衣的培养皿在37℃孵育至少1小时。 HiPSC菌落片段冷冻保存和解冻 切割hiPSC菌落后（参见步骤1.3的hiPSC菌落切割程序），轻轻慢慢地将hiPSC菌落片段重悬于干细胞冷冻培养基，〜100个片段/250μL（参见材料表）。 将菌落碎片等分于合适的小瓶中以进行冷冻保存（250μL/小瓶）。 将小瓶放入装有2-丙醇的容器中，并将容器放置在-80℃至少2小时，最多2周。 将小瓶转移到液氮罐的气相中。 要重新开始培养，在37℃的水浴中解冻1个冷冻小瓶。 在7 mL预热的完整hiPSC中轻轻收集hiPSC菌落片段培养基（参见材料表 ），使用1,2或5mL移液管在15mL管中。 将hiPSC菌落碎片以130×g离心3分钟。 取出上清液，并使用1,2或5 mL移液管轻轻将hiPSC菌落碎片重悬于1 mL完整的hiPSC培养基中。 进一步稀释3或4 mL完整的hiPSC培养基中的细胞悬液。 在合格的基质涂覆的60mm培养皿（〜100片/碟;如步骤1.1中所述包衣的盘子）上放置hiPSC菌落碎片。 在37℃和5％CO 2下孵育hiPSC。 每天进行一次中等的改变。 传播hiPSC菌落 注意：未分化的hiPSC应该是圆形的，具有大的核仁和没有丰富的细胞质。未分化菌落的特征应该是平坦且紧密堆积的形态。只有未分化的菌落（约1毫米，n直径）应进行切割以进一步传送。 使用具有30G针或任何其他市售工具的1-mL注射器切割约200μm×200μm的正方形的干细胞集落（参见材料表）。在室温下在层流柜中以4倍放大率使用立体显微镜。 使用200μL移液管，从培养皿表面分离菌落碎片，轻轻移取底下的培养基以提起碎片。 将菌落碎片（〜100片）转移到装有4mL完整hiPSC培养基的合格基质DMEM / F12涂覆板（参见材料表;如步骤1.1所述包衣）。 在37℃和5％CO 2下孵育新板。 每天进行一次全面的介质变化，并使用4倍和10倍放大倍数的相差显微镜检查菌落的形态。 HiPSC的差异混合神经元和胶质细胞注意：程序大约需要28天才能完成，主要步骤如图1 （上半部分）所述。 图1：神经元分化方案的示意图。 （上部）IMR90-hiPSC菌落可以切成片段形成胚状体（EB）。 体外培养 2天后，将EBs铺在层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿上，并在神经上皮诱导培养基（NRI）培养基中培养，产生神经外胚层衍生物（玫瑰花结，这里染色巢蛋白（绿色）和β -III-微管蛋白（红色））。玫瑰果可以在层粘连蛋白或标准基质包被的培养皿上解离，收集，复制，并进一步分化成成熟神经元（NF200，红色）和胶质细胞（GFAP，绿色）细胞在神经元分化（ND）培养基存在下。 （下部）玫瑰花源衍生的NSCs（巢蛋白，红色）可以在存在神经诱导（NI）培养基的情况下扩增，冷冻保存，或在ND培养基存在下进一步分化，形成混合神经元（NF200，绿色）和胶质细胞GFAP，红色）培养。 请点击此处查看此图的较大版本。 胚胎体（EB）的生成（第0→1天） 注意：此过程需要良好的手动技能和精度。 HiPSC菌落片段应具有相同的大小，以在后续步骤中获得均质的胚状体（EB）。应该丢弃形态上分化的菌落（具有大细胞质级分和小核仁）。 在切割未分化的hiPSC菌落（约1毫米直径）之前，先刷新hiPSC培养基（3mL / 60mm培养皿）在无菌条件下（如步骤1所述）参见图2A ）。 使用具有30G针的1-mL注射器将未分化的菌落（ 如图2A和图2B所示 ）切割成约200μm×200μm的片段。在室温下在层流柜中以4倍放大率使用立体显微镜。 使用200μL移液管，从培养皿表面分离菌落碎片，轻轻移液培养基，以提起碎片。 使用1,2或5 mL移液管将所有分离的碎片和培养基转移到15 mL管中。 用2 mL完整的hiPSC培养基冲洗盘子，以回收所有碎片。 以112 xg离心1分钟。 吸出上清液并轻轻地将片段重悬于5 mL完整的hiPSC EB培养基中（见材料表 ）。 板公司在60mm超低附着培养皿（5mL / 60mm培养皿）中的Lony碎片。 在37℃和5％CO 2下孵育培养皿过夜。 第二天（第1天），使用1,2或5 mL移液管将EBs及其培养基收集在15 mL管中。 以112 xg离心EB 1分钟。 仔细吸取上清液，并使用1,2或5 mL移液管轻轻将EB悬浮于5 mL完整的hiPSC EB培养基中。 将EB替换到新的60毫米超低附着培养皿（5毫升/ 60毫米培养皿）上。 在37℃和5％CO 2下孵育培养皿过夜。 在第1天，用基底膜基质（ 例如，基质胶，以下称为“标准基质”）或任何其它合适的蛋白质底物（ 例如层粘连蛋白）包衣。 在-80°C储存标准基质（参见材料表 ）使用冷的1.5毫升管和冷的5毫升或10毫升移液管的200μL等分试样。 在冰上解冻200μL标准基质。 在20mL DMEM / F12培养基（1:100稀释）中稀释200μL标准基质。 用该溶液（5mL /皿）涂上60mm培养皿。 将包衣的菜肴在37℃下孵育过夜。 注意：这些菜肴将用于平铺EB（约50个EB /碟）并产生神经上皮聚集体（玫瑰花结）;见步骤2.3。 神经上皮聚集体（玫瑰花结）的产生（第2天→第7天） 在第2天，从60 mm培养皿中取出标准基质涂层溶液（无需冲洗板），并填充5 mL /皿的完整神经上皮诱导培养基（NRI）;见材料表 。 将漂浮的EB（从步骤2.1.14）转移到涂覆的盘（〜50个EB /皿）上，使用200μL移液管在立体mi以4倍放大倍率放置在层流柜中。 注意：选择均匀的中等大小的EB（直径约200-300μm）至关重要。神经外胚层分化过程中，太小的EBs可能不能很好地存活，而过大的EB往往会发生核心坏死。 在37℃和5％CO 2下孵育。 在第二天（第3天）之后，以10倍放大倍率在显微镜下检查菜肴，以确保所有的EB都被连接。 使用完整的NRI培养基轻轻地进行中等变化。 每天第二天将NRI培养基更换至第7天，当神经上皮聚集（玫瑰花结））应可见时。 在第7天，如步骤2.2所述将标准基质（或层粘连蛋白）涂覆到任何所需的板或盘形式：96孔板（100μL/孔），24孔板（250μL/孔），12-孔板（500μL/孔），MEA芯片（用于电活动，1mL /单孔芯片）或60mm Petri dishes（4mL /皿）。 在37℃和5％CO 2下将涂覆的板/皿孵育至少2小时。 玫瑰花解离和神经元分化（第8〜28天） 注意：此过程需要良好的手动技能和精度。为了避免收集中胚层和内胚层细胞，只应外分泌和收集外胚层类玫瑰花结构。 在第8天，在无菌条件下，在立体显微镜下以10倍放大倍数将玫瑰花状结构切成碎片。使用带有30G针头的1 mL注射器。请注意，当与针接触时，花环容易从盘中脱离。 使用200μL移液管完成玫瑰花瓣碎片的分离。 将盘子转移到层流罩下方，并使用1,2或5毫升移液管将玫瑰花瓣碎片及其培养基收集到15 mL锥形管中。用2mL的NRI培养基冲洗该培养皿以恢复所有片段。 以112 xg的速度旋转玫瑰花瓣碎片2分钟。 吸出上清液。 轻轻地将沉淀物重悬于1毫升1x DPBS（不含钙和镁）中，并使用1,000μL移液管轻轻吸取玫瑰花瓣碎片，使其部分解离。 加入4 mL完整的NRI培养基，并用台盼蓝和自动细胞计数器计数细胞（参见材料表 ） 注意：将20μL细胞悬浮液稀释成20μL台盼蓝。如果细胞不能进入单细胞悬浮液，则可以省略该步骤。如果莲座碎片看起来没有完全解离，则从约50个EB / 60-mm皿中衍生的玫瑰花粉碎片可以重新悬浮在50mL的完整NRI培养基中并铺板，如表1所示 。 从培养皿，平板和/或MEA碎片吸出标准基质（或层粘连蛋白）涂层溶液（来自步骤2.3）。7）。不要让他们干根据研究计划（约15,000个细胞/ cm 2 ; 参见表1的电镀体积适应症）将细胞在完整的NRI培养基中培养。 在37℃和5％CO 2下孵育板过夜。 在第10天，使用完整的神经元分化培养基（ND）进行总介质变化;见材料表。 每周两次刷新完整的ND培养基，直到第28天。 描述神经元/神经胶质细胞衍生物，如步骤5所述（ 参见表2的一般验收标准）。 3. HiPSC衍生的神经干细胞（NSC）扩增和分化成混合神经元和胶质细胞注意：从玫瑰花序片段衍生的神经干细胞可以按照下述步骤进行扩展和维护（ 图1 ，下图 ）。这允许增加the用于分化和化学测试的细胞数。 用60 mL标准基质DMEM / F12涂层溶液涂抹60 mm培养皿（或T-25烧瓶），并在37°C和5％CO 2下孵育至少2 h（如步骤2.2所述）。 将圆锥形15 mL管中的步骤1-2（见步骤2.4。），以112 xg的速度旋转2分钟。 将沉淀轻轻重悬于5 mL神经诱导培养基（NI）中;见材料表。 将细胞转移到标准基质涂层的60mm培养皿（或T-25烧瓶）上。 在NI培养基存在下培养玫瑰花结的神经干细胞，每隔一天刷新培养基直至细胞达到汇合。 汇合时，如以下步骤所述通过NSCs。 注意：每周一次通过NSCs;考虑使用新鲜包装的菜肴，烧瓶或盘子，这取决于研究计划。 取出完整的NI培养基和gentl用DPBS（不含钙和镁）冲洗NSCs。 向装有细胞的60-mm培养皿（或T-25烧瓶）中加入预先温热至37℃的1.5mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA，并置于培养箱中1分钟。 轻轻敲打盘（或烧瓶）以分离细胞。 加入预先温热至37℃的1.5 mL胰蛋白酶抑制剂，并将细胞转移至15 mL管中。 用等体积的NI培养基（1.5mL）冲洗培养皿（或T-25烧瓶），并将体积收集在相同的15-mL管中。 将细胞以130×g离心3分钟。 去除上清液，并使用1,000μL移液管轻轻将细胞重悬于1 mL完整的NI培养基中。 进一步稀释3或4 mL完整的NI培养基中的细胞悬浮液，并使用台盼蓝和自动细胞计数器计数细胞。 将NSCs以约50,000个细胞/ cm 2的密度从步骤3.1将NSCs平板化到60-mm培养皿（或T-25烧瓶）上。 <li>每隔一天用完整的NI培养基进行总体介质变化。 表征细胞是否存在神经元/神经胶质细胞衍生物，如步骤5所述。 注意：NSCs可以在完整的ND培养基中分化成神经元和神经胶质的混合培养物（如步骤2.4.11-2.4.13所述），每周二次清洁完整的ND培养基21天。 4. HiPSC衍生的NSC冷冻保存和解冻注意：传代后，按照这个程序，NSCs可以冷冻并重新融化。 将离心的NSCs（来自步骤3.12）以130×g离心3分钟。 注意：细胞应在步骤3.14进行计数。 轻轻和缓慢地重新悬浮在3×10 6 / mL冷冻介质中的NSCs（参见材料表 ）。 将细胞等分于合适的小瓶中用于冷冻保存（约0.5mL = 1.5×10 6 /小瓶）。 将小瓶放入容器中装入2-丙醇，将容器放在-80°C至少2小时，最长可达2周。 将小瓶转移到液氮罐的气相。 重新开始细胞培养，在37℃的水浴中解冻1个冷冻小瓶。 使用1000μL移液管在15 mL管中轻轻收集7 mL预热的完整NI培养基中的细胞。 将细胞以130×g离心3分钟。 取出上清液，用1000μL移液管轻轻将细胞重悬于1 mL完整的NI培养基中。 进一步稀释3或4 mL完整的NI培养基中的细胞悬浮液，并使用台盼蓝和自动细胞计数器计数细胞（注意：20μL台盼蓝稀释20μL细胞悬浮液;解冻后的存活率应≥80 ％）。 以约50,000个细胞/ cm 2的密度将NSCs放置在涂覆的60-mm培养皿（或T25烧瓶）中。 CharahiPSC衍生的神经元和神经胶质细胞的整合注意：分化后，神经元和神经胶质衍生物可用不同的技术进行表征，如以下部分所述的技术。 定量实时PCR（qPCR）分析10 将hiPSC菌落碎片，EB和/或NSCs以130×g离心3分钟。 将细胞沉淀重悬在100μL冷RNA溶解缓冲液中，提供在合适的RNA提取试剂盒中。 或者，通过吸出培养基直接从平板收集神经元/神经胶质衍生物，并向孔中加入冷RNA裂解缓冲液以收集细胞。 按照制造商的说明隔离RNA。 逆转录500纳克的总RNA使用合适的RNA套件到cDNA逆转录。 使用适当的主混合物和底漆，重复使用qPCR反应套（见材料表 ）。 记录荧光发射实时：45个循环，引物在60℃退火。 将GAPDH和β-肌动蛋白的相对RNA量归一化为参考基因，并使用未分化的hiPSC或未处理的细胞进行校准条件（ΔΔCt方法）。或者，使用另一种合适的方法。 免疫细胞化学和高含量成像（HCI） 6,11 在室温下用冷的4％多聚甲醛固定hiPSC菌落，NSCs和/或神经元/胶质细胞衍生物15分钟。 轻轻洗涤1X PBS中的细胞，并将板在4℃下储存长达1个月。 准备进行染色时，在室温下将渗透缓冲液（含有0.1％triton-X-100和3％BSA的1×DPBS）中的细胞透化15分钟。 去除渗透液在室温下将细胞在封闭缓冲液（3％BSA / 1X DPBS）中孵育15分钟以防止抗体的非特异性结合。 取出封闭缓冲液，并在含有合适的一抗的封闭缓冲液中于4℃孵育细胞过夜（参见材料表 ）。 用1x PBS洗涤细胞3次。 在含有荧光染料缀合的二级抗体的封闭缓冲液中，在室温下孵育细胞45分钟（参见材料表 ），用DAPI染料重新染色细胞核。 使用合适的高含量成像平台（如果有的话）量化平均荧光强度和细胞类型的相对百分比（参见材料表 ）。 注意：为了确定荧光背景的强度水平，单独用二次抗体孵育一些细胞/孔。流动细胞分析活（不固定），和可以进行分化的hiPSC以评估PSC特异性标记物如SSEA4 的表达 （参见材料表 ）。按照制造商的说明书，可以使用市售的BCIP / NBT试剂盒分析未分化的hiPSC菌落碱性磷酸酶活性（参见材料表 ）。另外，如参考文献12（测试抗体列表，参见材料表 ）所述，可以进行反相蛋白质阵列（RPPA）测定和分析。 电生理测量13 在完整的ND培养基（〜1×10 5个细胞/单孔MEA芯片）中，将衍生自玫瑰花簇上的解离的玫瑰花束片段（7DIV）或衍生自包被的多电极阵列上的玫瑰花簇（MEA;参见材料表 ）。 在完整的ND培养基中分化细胞3周，清爽e媒体每周两次。 在分化结束时，用层流罩下的半透膜密封MEA碎片，以保持培养物无菌以进行重复测量。 用一个接地参考电极替换一个电极，允许从剩余电极进行记录。 使用MEA放大器记录平均燃烧速率（MFR;峰值/分钟数），将集成温度过程控制调整到37℃和5％CO 2 。 使用阈值限制-4.7σ（σ表示基础噪声的标准偏差）从MEA原始数据中检测峰值。 使用合适的软件处理后记录数据。