न्यूरोनल सर्किट पुनर्जीवित: फास्ट न्यूरैट एक्सटेंशन और फंक्शनल न्यूरॉनल कनेक्शन के लिए एक नई विधि
Summary
यह प्रक्रिया बताती है कि माइक्रो-फ्लोट्यूइडिक कक्षों में नियोजित न्यूरिटियों को तेजी से शुरू, विस्तार और कनेक्ट करने के लिए कैसे पॉली-डी-लाइसिन-लेपित मोतियों का उपयोग माइक्रोप्रोप्टेट्स के लिए तय किया गया है जो कि न्यूरैट फैलेगेट को मार्गदर्शन करता है।
Abstract
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की चोट से स्थायी अक्षमता और मृत्यु हो सकती है क्योंकि यह अभी भी लंबी दूरी पर न्यूरॉन्स को पुनर्जन्म करने के लिए संभव नहीं है और उन्हें उचित लक्ष्य के साथ फिर से जोड़ने के लिए संभव नहीं है। यहां एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है कि लंबी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किट को तेजी से आरंभ, बढ़ाना और सटीक रूप से जोड़ना। विस्तार दर 1.2 मिलीमीटर से अधिक तक पहुंच गई, जो कि परिधीय तंत्रिका तंत्र (0.02 से 0.04 मिमी / एच) से सबसे तेजी से बढ़ते अक्षरों के विवो दरों की तुलना में 30-60 गुना तेजी से 28 और 10 गुना तेज होती है, इससे पहले की तुलना में इसकी तुलना में 10 गुना तेज है विकास के पहले चरण में न्यूरॉनल टाइप 4 सबसे पहले, चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की पृथक आबादी माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में 2-3 सप्ताह के लिए विकसित होती है जिससे कि कोशिकाओं को सटीक रूप से पेश किया जा सके, जिससे आसान माइक्रोमैनलिपीलेशन और प्रयोगात्मक प्रजननशीलता को सक्षम किया जा सके। इसके बाद, पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) के साथ लेपित मोती न्यूरेट्स पर चिपकने वाले कंटेनर बनाने के लिए रखे जाते हैंकार्य और विंदुक micromanipulation के परिणामस्वरूप मनका- neurite जटिल ले जाने के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसा कि मनका ले जाया जाता है, यह एक नया न्यूरेट निकालता है जिसे सैकड़ों माइक्रोमीटर तक बढ़ाया जा सकता है और 1 घंटे से कम समय में एक लक्ष्य सेल से कार्यात्मक रूप से जुड़ा हो सकता है। यह प्रक्रिया प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और हेरफेर में आसानी बनाता है जबकि धीमी रासायनिक रणनीतियों को न्यूरेट विकास को प्रेरित करने के लिए छोड़कर। यहां प्रस्तुत प्रारंभिक मापन एक न्यूरोनल विकास दर को दर्शाता है जो शारीरिक स्तरों से अधिक है। इन नवाचारों के संयोजन से अभूतपूर्व नियंत्रण के साथ संस्कृति में न्यूरॉनल नेटवर्क की सटीक स्थापना की अनुमति मिलती है। यह एक नई पद्धति है जो न्यूरोनल नेटवर्क के भीतर सिग्नल ट्रांसमिशन और संचार के साथ-साथ न्यूरॉनल ग्रोथ की सीमाओं का पता लगाने के लिए एक खेल का मैदान होने के साथ-साथ सिग्नल ट्रांसमिशन और संचार की अधिक जानकारी और अंतर्दृष्टि के लिए दरवाजा खोलता है। न्यूरोना को फिर से जोड़ने का लक्ष्य रखने वाले चिकित्सा के लिए संभावित प्रभावों और प्रयोगों के प्रत्यक्ष प्रभाव के साथ व्यापक हैंएल सर्किट आघात के बाद या neurodegenerative रोगों में।
Introduction
वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की चोटों की वजह से कई तंत्रों की वजह से स्थायी अक्षमता हो सकती है जो अक्षतंतु रेग्रोथ 1 को सीमित करती हैं। चोट के बाद, कई सीएनएस अक्षतंतु एक नया विकास शंकु नहीं बनाते हैं और एक प्रभावी पुनर्योजी प्रतिक्रिया 2 माउंट करने में विफल हैं। इसके अलावा, सीएनएस घावों के आस-पास क्षति और निशान ऊतक काफी अक्षत वृद्धि 1 , 2 , 3 को बाधित करते हैं। चोट के बाद सीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए वर्तमान उपचार घायल न्यूरॉन के आंतरिक विकास की क्षमता को बढ़ाने और मायेलिन मलबे और ग्लेल निशान 1 , 3 से जुड़े अक्षीय विस्तार के अवरोधकों को मास्क करने पर केंद्रित है। इसके बावजूद, लंबे अक्षरों को दूर के लक्ष्यों को पुनर्जीवित करने और उचित कार्यात्मक संक्रमणों को बनाने की क्षमता गंभीर रूप से सीमित होती है 4 , </suP> 5 , 6 , 7
वर्तमान कार्य में, लंबी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किटों को तेजी से आरंभ, लम्बी और सटीक रूप से जुड़ने के लिए माइक्रोबॉइड्स, विंदुक माइक्रोमैनिप्युलेशन, और माइक्रॉफ़्लिडिक डिवाइस का उपयोग किया जाता है। पिछला काम से पता चला है कि पॉली-डी-लाइसिन-लेपित मोती (पीडीएल-मोती) ने झिल्ली के आसंजन को अन्तर्ग्रथनी पुटिका परिसरों के क्लस्टरिंग के बाद और कार्यात्मक प्रीसंन्प्टिक बॉटन 8 का निर्माण किया । यह भी दिखाया गया था कि जब प्रीपेनैप्टिक भेदभाव के बाद पीडीएल-मनका तंत्रिकी रूप से खींचा जाता है, तो अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन क्लस्टर मढ़ते, एक नया न्यूरेट 9 की शुरुआत करता है। निम्न प्रक्रिया इस तथ्य को साथ ही साथ एक न्यूरॉनल रिवायर करने के लिए पॉलिडीमेथाइलसिलोक्सीन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइसों का उपयोग कर एक कंडोली पर संगठित क्षेत्रों में संस्कृतियों के भ्रूण के हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की क्षमता के साथ काम करती है।सर्किट।
इन PDMS माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस गैर विषैले, ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं और माइक्रोचैनेल की एक प्रणाली से जुड़े दो कक्षों से मिलकर होते हैं। एक बार कंडोली पर इकट्ठा होने पर, प्रत्येक डिवाइस न्यूरोनल विकास की मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करता है और इन विट्रो में 4 सप्ताह से अधिक समय तक सटीक पैटर्न पर स्वस्थ न्यूरोनल संस्कृतियों को बनाए रखता है।
यहां, एक रूपरेखा प्रस्तुत की गई है जिसमें नए न्यूरेट के विस्तार और कार्यक्षमता की सीमाओं की जांच करना है। नए, कार्यात्मक neurites बनाए गए हैं और (पुनः) तार neuronal नेटवर्क को नियंत्रित करने के लिए तैनात मिली विस्तार की दर 20 मिलीमीटर / मिनट से मिलीमीटर की दूरी पर होती है और कार्यात्मक कनेक्शन स्थापित होते हैं। ये परिणाम, अप्रत्याशित रूप से दिखाते हैं, कि विस्तार के लिए इन न्यूरियों की आंतरिक क्षमता पहले सोचा था कि पहले से कहीं ज्यादा तेज है। यह प्रस्तावित यांत्रिक दृष्टिकोण धीमी रासायनिक रणनीतियों को छोड़कर और एक विशिष्ट लक्ष्य को नियंत्रित कनेक्शन सक्षम बनाता है। गुतकनीक है कि चोटों के बाद न्यूरोनल कनेक्टिविटी को बहाल करने के लिए इनवेरो अध्ययन में इनवेस्ट्रॉल के नए रास्ते खुलता है। यह इन्रोरो में न्यूरॉनल सिग्नल प्रोसेसिंग और न्यूरोनल फ़ंक्शन के मौलिक पहलुओं की जांच करने के लिए न्यूरॉनल नेटवर्क के हेरफेर और रेविंग को भी सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानक माइक्रोमैनिपुलेशन और अभिनव माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करना, बड़ी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किटों को तेजी से आरंभ, लम्बी और सटीक रूप से जोड़ने के लिए एक नई तकनीक विकसित की गई थी। पिपेट ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कई उपयोगी चर्चाओं और अंतर्दृष्टि के लिए योइची मियाहारा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। एमएसए और पीजी ने एनएसईआरसी से धन का स्वीकार किया।
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
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