Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van het gebruik van dieren door de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Johns Hopkins School of Medicine. 1. Isolatie en cultuur van muis hippocampale neuronen Ontleden cortex uit een postnatale dag 0 – dag 2 (P0 – 2) muizenhersenen 18. Isoleer de astrocyten van de cortex. NB: De hersenen van muizen werd geïsoleerd na onthoofding. Astrocyten dienen als een voedingslaag van hippocampale neuronen. Behandel de cortex met 800 ui 0,05% trypsine-EDTA gedurende 15 minuten bij 37 ° C om de astrocyten dissociëren. Cultuur de astrocyten in een T-75 kolf met 13 ml DMEM dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,2% penicilline-streptomycine gedurende één week bij 37 ° C en 5% CO2. Plaats een zuur gewassen en gesteriliseerde 18 mm glazen dekglaasje per putje van een 12-wells plaat. Spoel even twee 6 mm koolstof beklede saffier schijven in 70% ethanol en plaats ze op elkaar dekglaasje. Bereid Poly-D-lysine-oplossing (PDL) door mengen van 3 ml 17 nM azijnzuur met 1 ml rattenstaart collageen en 1 ml PDL (1 mg / ml). Toepassing 200 pi van PDL oplossing van het saffier schijven en dekglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de PDL-oplossing en drogen. Vóór gebruik steriliseren plaat zoals bereid in de stappen 1,4-1,6 gedurende 30 min onder ultraviolet licht. Zaad van de astrocyten uit stap 1.3 in 2 ml DMEM met een dichtheid van 5×10 4 cellen / putje in de plaat zoals bereid in de stappen 1,4-1,6. Ze groeien bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende één week. Voeg 20 ul van fluor-deoxyuridine (eindconcentratie 80 uM) aan elk putje gedurende ten minste een paar uur voor het kweken van de neuronen. OPMERKING: Fluor-deoxyuridine stopt astrocyten divisie. Verander het medium 1,5 ml van neuronale basal medium (zie tabel of Materials) dat 1% L-alanyl-L-glutamine (zie tabel of Materials), 2% serumvrij supplement voor neuronale cellen (zie de tabel van Materialen), en 0,2% penicilline-streptomycine . Bereid papaïne oplossing door toevoeging van 20 eenheden van papaïne 5 ml enzymoplossing (1,65 mM cysteine, 1 mM CaCl2 en 0,5 mM EDTA in DMEM). Zuur de oplossing door het passeren CO2 gas gedurende 20 minuten. Filter-steriliseren met een 0,22 urn filter. Oogst de hersenen van een P0 – 2 muis 18. Onmiddellijk overdracht van de hersenen om ijskoude Hanks'-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Ontleden de hippocampus onder een stereomicroscoop, waarbij het weefsel ondergedompeld in HBSS. Zet de twee hippocampus in 1 ml van de papaïne bereid in stap 1.11. Incubeer gedurende 1 uur op een thermomixer bij 37 ° C en 750 rpm. Vervang papaïne met 1 ml oplossing die inactiverende2,5 mg trypsineremmer en 0,5 mg albumine per ml DMEM. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Aspireren uit het inactiverende oplossing. Voeg 200 ul van neuronale basale medium (zie de tabel van Materialen) aan de geïsoleerde hippocampus. Vermaal behulp van een 200 pi pipettip om de cellen te dissociëren. Wacht tot de gedissocieerde cellen naar de bodem zakken. Verwijder het medium voorzichtig met cellen van de top. Herhaal stap 1.15 3x. Zwembad alle gedissocieerde cellen in een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Neuronen plaat bij een dichtheid van 6,5 x 10 4 cellen / putje bovenop de astrocyten laag bereid in stappen 1,1-1,10. Infecteren de neuronen met lentivirus expressie channelrhodopsin ten DIV 3 (3 d in vitro) 18. Uitvoeren van flash-en-bevriezing van DIV 14, volgens de beschrijving bij 2,1-2,5, hieronder. 2. Flash-and-Freeze Bereiding van Fixatief Onder een chemische motorkap, de volgende stoffen een conische buis met het fixeermiddel bereid: 2,5 ml glutaaraldehyd (10% voorraad in aceton), 0,25 g osmiumtetroxide, 0,25 ml water en 22,25 ml watervrije aceton. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elke component moet 1% in aceton zijn. Glutaaraldehyde toegevoegd aan de eiwitstructuur tijdens bevroren bewaren substitutie. LET OP: De acute toxiciteit van osmiumtetroxide is hoog. Blootstelling aan de dampen kan het hoornvlies van het oog beschadigen. Het mag alleen in een gecertificeerde chemische kap worden behandeld. Aliquot 1 ml fixeeroplossing in genummerde cryogene flesjes (2 ml). Houd het fixeermiddel ingevroren in vloeibare stikstof tot gebruik. OPMERKING: Osmiumtetroxide en glutaaraldehyde kruisreageren en precipiteren; Wanneer dus gemengd monster onmiddellijk cap de buizen, en dompel de cryotubes in vloeibare stikstof om het fixeermiddel bevriezen. Gebruik een potlood om de cryo nummerenoestrogene flesjes, kan aangezien aceton wassen markers. Bereiding van fysiologische zoutoplossing Voeg fysiologische zoutoplossing door mengen Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) en glucose (10 mM). LET OP: Deze waarden zijn uiteindelijke concentraties. Cryo-beschermingsmiddelen worden niet gebruikt voor monolayer kweken. Echter, is een goede cryo-beschermende vereist voor monsters dikker dan 5 urn. Het gebruik van 20% BSA wordt gewoonlijk aanbevolen. Gist plakken en E. coli OP50 kan ook worden gebruikt als cryo-beschermers voor vliegenlarven of C. elegans. Voeg CaCl2 bij 4 mM MgCl2 en 1 mM eindconcentratie. LET OP: De concentraties van CaCl2 en MgCl2 variëren afhankelijk van experimenten. De vangst van exocytose tussenproducten waarborgen, wordt 4 mM calciumchloride gebruikt voor deze specifieke experimenten om de afgifte waarschijnlijkheid van 18 vesicles verhogen. Controleer deosmolariteit met behulp van een osmometer. Zorg ervoor dat het 300 ± 5 mOsm. Voeg AMPA receptorantagonist (NBQX) tot een eindconcentratie van 3 uM en GABA receptor antagonist (bicuculline) tot een eindconcentratie van 30 uM. OPMERKING: Neurotransmitter receptorantagonisten worden toegevoegd om de vaste netwerkactiviteit volgende neuronale stimulatie 18 voorkomen. Warm het fysiologische zoutoplossing tot 37 ° C voor gebruik. Bereiding van de gespecialiseerde Hogedruk vriezer en een Automated Freeze Substitutie Unit Vóór hogedruk vriezen, koelen een automatische bevriezing substitutie eenheid tot -90 ° C door het vullen van de tank met vloeibare stikstof. Afkoelen aceton in een kleine beker tot -90 ° C door deze in de monsterkamer. Vult de vloeibare stikstof Dewar en opslag Dewar van de hogedruk vriezer (zie tabel of Materials) met vloeibaar nitrogen. Stel het licht stimuleringsprotocol via het touch screen monitor. Noem het programma door te klikken op "Bewerken" naast "Program naam" aan het licht stimulatie venster. Een ander venster verschijnt. Een programma van typen "15000 ms" in "donkere fase," "100 ms" in "periode" "10 ms" in "puls" en "1" in "aantal perioden" voor een enkele stimulus van 10 Mevr. Bevries de cellen 90 ms later (figuur 1C). OPMERKING: De "donkere fase" kan de cellen om te herstellen van blootstelling aan licht tijdens het laden van het monster. "Periode" bepaalt de stimulatiefrequentie. Bijvoorbeeld, als de stimulus worden toegepast bij 20 Hz, deze kolom worden ingesteld op 50 ms. "Pulse" bepaalt de duur van het licht stimulus. Tenslotte het "aantal perioden" definieert het totale aantal stimuli toegepast. Voor het opzetten van een hoogfrequente stimulatie, zie <strong> Figuur 1E. Een "geen stimulatie" control, type "15 s" in "donkere fase," "0 ms" in "periode" "1 ms" in "puls" en "0" in "aantal perioden" in het licht stimulatie setup venster, zoals beschreven in stap 2.3.4. OPMERKING: Standaard wordt de "puls" moet ten minste 1 ms. Op het hoofdscherm, zorg ervoor dat de doos voor lichte stimulatie wordt gecontroleerd. Stel de opslag protocol door te klikken op "Specimen Storage" op het hoofdscherm. Klik op "Bewerken". In het volgende venster toetsen "+" of "-," naar "2" selecteren 2 schijven opgeslagen in elk kanaal (3 kanalen in totaal). Check "Opslag LN2 ingeschakeld." Sample laden en bevriezen in de hoge-druk Freezer LET OP: Alle het monster monteren en beladen stappen worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop met een 7.5-60X vergroting bereik. Een tweezer wordt in stappen 2.4.1 – 2.4.4 met de modellen manipuleren. Experimenten worden uitgevoerd bij fysiologische temperatuur. Plaats een saffierschijf, cel-zijde naar boven in de put van de zwarte, middenplaat (Figuur 1B). Plaats een 100 urn afstandsring via saffierschijf (Figuur 1B). Een blanco saffierschijf via afstandsring (Figuur 1B) na onderdompelen ene zijde van de schijf in de voorverwarmde zoutoplossing bij stap 2.2. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee saffier schijven. Plaats een 100 urn afstandsring en 400 urn afstandsring (Figuur 1B). Verwijder het extra vloeibare filterpapier. Leg het samenstel uit stap 2.4.3 tussen de twee transparante halve cilinders (Figuur 1A). Sluit de top rode kaft op de bevriezing te starten. OPMERKING: De vooraf ingestelde protocol wordt automatisch uitgevoerd wanneer het deksel gesloten. Het monster blijft in dezelfde oriëntatie in de vrieskamer en een lichtflits wordt van de bovenzijde van het monster samenstel. De rode cover terugspringt automatisch zodra de bevriezing proces is voltooid. Bewaar het model in de opslag Dewar. OPMERKING: Na het invriezen wordt het monster automatisch vallen in een opslagbuffer dewarvat gevuld met vloeibare stikstof en daar opgeslagen tot verdere verwerking. Opslag dewarvat drie kamers, en elke kamer kan maximaal 3 samples maximaal. Gewoonlijk worden twee monsters ingevroren onder dezelfde stimuleringomstandigheden, en de hogedruk diepvriezer geprogrammeerd om zowel slaan in dezelfde kamer. Herhaal stap 2.4.1 – 2.4.6 voor elk monster. Ga verder met stap 2.5 als alle kamers vol zijn. Opmerking Het apparaat werd ingesteld op maximaal 6 monsters in de opslag Dewar tegelijk. Dus na elke 6e monster stap 2.5 moeten worden uitgevoerd. Eenmaal gelost, herhaalt u de stappen 2.4.1 – 2.4.6. Monsterverzameling en overbrenging naar een Automated Freeze-substitutie Unit Open de deur naar de opslag dewarvat, dat zich onder de tafel van de hogedruk diepvriezer. Verwijder de opslag Dewar en plaats het op de benchtop. Gebruik handen, verwijder de monsterkamer van het dewarvat en overbrengen in de gespecialiseerde monsterblad gevuld met vloeibare stikstof. Ontgrendel de knop naar monsterbeker los. Verwijder het transparante halfcilinders van het monster beker met behulp van een pincet na het voorkoelen van de uiteinden van de pincet met vloeibare stikstof (-196 ° C ~). Breng voorzichtig de middelste, zwarte plaat een klein kopje met vloeibare stikstof. OPMERKING: De uiteinden van de pincetten worden voorgekoeld tot de temperatuur van vloeibare stikstof. Het monster moet onder vloeibare stikstof te allen tijde gehouden ijskristallen te voorkomen. 3. Freeze Vervanging bij Automated Freeze-substitutie Unit Gebruik voorgekoelde pincet (tips bij ~ 196 ° C), snel de middenplaat overbrengen van stap 2.5.3 naar de voorgekoelde aceton (-90 ° C). Scheid de saffierschijf vanuit het midden plaat door zachtjes te schudden of te tikken. OPMERKING: Af en toe kan het moeilijk zijn om de saffierschijf scheiden van de middelste plaat. In een dergelijke situatie, laat de middenplaat in vooraf gekoelde aceton (-90 ° C) gedurende enkele minuten. Zachtjes te tikken met een pincet helpt ook om de saffier distantiëren van de middelste plaat. Plaats een cryogene flacon met fixeermiddelen (stap 2.1) in een monsterkamer van de substitutie-eenheid. Breng de saffier schijf naar de cryogene flacon en plaats een kapje op de flacon. Stel de bevriezing substitutie programma als volgt: (i) -90 ° C gedurende 5-30 uur, (ii) -90 – -20 ° C in 14 uur (5 ° C / h), (iii) -20 ° C gedurende 12 uur, en (iv) -20 ° C – 20 ° C in 4 uur (10 ° C / h). OPMERKING: De duverhouding van de eerste trap bij -90 ° C kan worden gevarieerd. De totale duur van bevriezen substitutie wordt ingesteld zodanig dat het programma eindigt in de ochtend (-1,5 d postexperiment) rond 08:00 zodat de volgende stappen overdag worden uitgevoerd. 4. Infiltratie en Plastic Embedding met epoxyhars Zodra het programma eindigt Gebruik handschoenen om de cryogene flesjes die saffieren schijven dragen van de monsterkamer van de substitutie-eenheid aan een chemische kap. Gebruik een pipet aceton (kamertemperatuur) aan elk cryogeen flesje en wassen elke saffierschijf 4 – 6x gedurende 1-2 uur. Eventueel incubeer de monsters in 0,1% uranyl acetaat gedurende 1 uur als extra contrast nodig. Was 4 – 6x met aceton gedurende 1 – 2 uur. OPMERKING: WAARSCHUWING: Er is risico inwendige blootstelling na inhalatie van uranyl acetaat, die irritatie van de bovenste luchtwegen veroorzaakt. Hoge blootstelling kan damage bloedcellen. Werken met uranyl acetaat dient onder afzuiging. Beschermende kleding wordt aanbevolen. Bereid vloeibare epoxyhars medium door weging 6,2 g glycerolpolyglycidylether, 4,4 g bisfenol-A epoxyhars en 12,2 g dodecenylbarnsteenzuuranhydride (DDSA). Meng goed en voeg 800 ul van benzyldimethylamine (BDMA) tijdens het mengen. DE-gas gedurende 10 minuten. Bereid 30, 70, en 90% epoxyhars in aceton van 100% epoxyhars bereid in stap 4.4. Voeg 30% epoxyhars de cryogene flesjes die saffier schijven en incubeer gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting bij 120 opm. Vervang 30% epoxyhars met 70% epoxyhars door pipetteren en incubeer gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting. Met een pincet, dragen elk saffierschijf, cel-side-up, om de dop van de capsule insluiten. Voeg 90% epoxyhars met de kap. Incubeer O / N bij 4 ° C. De volgende dag vers maken epoxyhars medium, zoals in stap 40,4. Transfer elke saffierschijf, cel-zijde naar boven op de kap van de capsule insluiten. Vul de kap met vers bereide 100% epoxyhars. Ga verder met verse 100% epoxyhars elke 2 uur, driemaal herhalen. Plaats de monsters in een 60 ° C oven gedurende 48 uur te polymeriseren. 5. Montage Monsters Het monster ondersteboven op de stereomicroscoop zodat de saffierschijf bevindt zich aan de bovenkant van het harsbed blok. Verwijder de dunne laag epoxyhars van bovenaf door krassen met een scheermes. Met behulp van een scheermesje, snijd een ondiepe lijn langs de rand van de saffierschijf; deze lijn helpt de saffierschijf scheiden van de epoxyhars in stap 5.3. Scheid de saffierschijf van de epoxyhars door dompelen in vloeibare stikstof gedurende ongeveer 10 s. LET OP: De cellen zullen blijven in de epoxyhars. Na verwijdering van de saffierschijf Gebruik een dissectie scope naar een gebied met cellen te vinden (4-10X vergroting). Knip het interessegebied (~ 2 x 2 mm) met een scheermesje (tweesnijdend). Het model in plaats te houden, voert deze stap terwijl het monster wordt geplakt op het oppervlak van de microscoop. Monteer het stukje plastic (~ 2 x 2 x 5 mm) die de cellen met behulp van lijm met ethylcyanoacrylaat een cilindrische dummyblok gemaakt van epoxyhars. Incubeer het blok bij 60 ° C gedurende 1 uur. 6. Sectioning Gebruik een ultramicrotoom paragraaf het monster. Bekleding van het oppervlak van de kunststof ingebedde specimen met een glazen mes met een snelheid van 3 mm / s en een dikte van 200 nm / sectie. Cut 4-5 delen van het oppervlak waar de astrocyten bevinden. Overschakelen naar een diamanten mes en wordt met een snelheid van 0,8 mm / s en een dikte van 40 nm / sectie. Cut 20-25 secties. Verzamel linten secties van één slot koperen roosters bedekt met 0,7% polyvinylacetaat (ziede Table of Materials). 7. Imaging Met behulp van een Transmission Electron Microscope (TEM) Voorafgaand aan beeldvorming TEM, vlek het gedeelte met 2,5% uranylacetaat in methanol gedurende 5 minuten. Was het rooster 15x in 50% methanol. Daarna wassen in ultrapuur water 15x, met elke wasbeurt gedurende 30 s. Kort aan de lucht drogen sectie en plaats het rooster in een monsterhouder van de TEM. Beeld bij 93,000X vergroting. Acquire beelden. OPMERKING: Imaging wordt meestal gedaan blind voor de tijdstippen of genotypes, en typisch ~ 200 beelden worden verzameld / tijdstip. 8. Image Analysis Analyseren van de beelden met behulp van een software (bijvoorbeeld ImageJ) met een aangepaste macro (Watanabe, Davis, en Jorgensen, niet gepubliceerd). OPMERKING: De x / y-coördinaten worden geregistreerd vanaf blaasjes, de plasmamembraan, de actieve zone membraan en alle andere aan membraan gebonden organellen bij synapsen. De tekst files met de gegevens worden geëxporteerd naar andere software (bijvoorbeeld Matlab). De gegevens worden verder geanalyseerd met behulp van aangepaste programma's.