İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi
Summary
İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.
Abstract
Blastosist (genellikle üçüncü gün E3.5 de) iç kütleden izole fare embriyonik kök hücreleri (ESCs), erken dönemde embriyo gelişimini incelemek için in vitro model sistemi olarak da kullanılabilir. lösemi inhibe edici faktör (LİF) yokluğunda, EKH nöral öncü hücrelerine varsayılan göre farklılık göstermektedir. Onlar yüzünden erken evre embriyo olan benzerliği küresel agrega Embriyoit gövdeyi (EB) adı verilen üç boyutlu (3D) içine topladığı edilebilir. EBS iki boyutlu (2D) uzantıları büyüterek genişletmek nerede, fibronektin kaplı lamelleri numaralı seribaşı, ya da küremsiler olarak büyümeye devam ve üç germ içine ayırt 3D kollajen matrislerinde implante edilebilir: endodermal, mezodermal ve ektodermal. 3D kollajen kültür 2D EBS daha yakından in vivo ortamda taklit eder. 2B EB kültür immunfloresan ve farklılaşmayı izlemek için imünolekelemeyle analizini kolaylaştırır. Biz iki adımlı nöral differentia geliştirdiksiyon protokolü. Birinci aşamada, EBS aynı zamanda, retinoik asit (RA) maruz bırakılarak ayırt etmek için uyarılan, asılı bırakma tekniği ile üretilen ve edilmektedir. İkinci aşamada, RA yokluğunda bir 2D veya 3D biçiminde sinir farklılaşma ilerler.
Introduction
EKH blastosist iç hücre kitlesi kaynaklanır. Menşe organizmanın herhangi bir hücre türü ayırt etme kapasitesine sahip, yani bu hücreler, embriyonik dokuda bulunurlar. ESC in vitro farklılaşma geliştirme yolunu ve mekanizmaları araştırmak için bir sistemde kadar geniş ilgi konusudur. Bu hücre ve doku disfonksiyonu düzeltmek için, yeni tedavi yaklaşımları test etmek için bir kuvvetli ve esnek bir model sistem sunmaktadır. EBS erken embriyogenez sırasında hücre farklılaşması birçok yönünü yeniden gündeme getirirler. Embriyo ölümüne yolaçtığı zor embriyonik kusurlar 1, 2, hücresel bir temel belirlemek için yapar Özellikle, EBS kullanılabilir. EBS asılı bırakma veya bir sıvı süspansiyon teknikleri 3 yoluyla oluşturulabilir. Eski avantajı böylece deneysel tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak tutarlı boyut ve yoğunluğu EBS üretme yeteneğidir.
<p ckız = "jove_content"> hücre dışı matris (ECM) yapışma proteinleri ile etkileşim yapışan hücre motilitesi ve hayatta kalmayı etkiliyor olabilir. 2B kültür sisteminde, fibronektin genellikle substrata hücre yapışmasını arttırmak için uygulanır. Fibronektin heterodimerleri 4 integrin hücre yüzeyine 10 türleri tarafından tanınan bir bazal lamina bileşenidir.RA sinir farklılaşmasını 5, 6 indükler A vitamini küçük lipofilik metabolitidir. RA yüksek konsantrasyonlarda sinir gen ekspresyonunu teşvik etmek ve EB formasyonu 7, 8 boyunca mezodermal geni ifade etmek. RA retinaldehit dehidrojenaz 9 tarafından nihai ürüne retinaldehit oksidasyon takip eder ya da alkol ya da retinol dehidrojenazı ile, retinaldehit için bir oksidasyon vitamini ile üretilir. Sinir farklılaşma sitoplazmadan RA taşınmasını gerektirir Hücresel RA-bağlayıcı protein 2 (CRABP2) ile çekirdeğe. Çekirdekte RA, RAR-RXR heterodimerin 10 oluşan bunun kognat reseptörü kompleksine bağlanmaktadır. Bu transkripsiyonel eş-aktivatörleri alımı ve transkripsiyon 9, 11 başlatılması ile sonuçlanır. Ayrıca, RA ve böylece BMP ve Smad 12 sinyal antagonize fosforile (aktif) SMAD1 bozunmasını geliştirmesidir. Bu faaliyetlerin yanı sıra, RA Pax6 ifadesini nöral farklılaşma 13 destekleyen bir transkripsiyon faktörü artar. RA sinyal sirtuin-1 (SIRT1), nükleer nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) 'modüle edilir – çekirdeğe translokasyonu ile müdahale, CRABP2 deacetylates bağlı bir enzim ve bu nedenle RA, RAR-RXR heterodimerin 14, 15 bağlanma ile, 16.
e_content "> Burada anlatılan RA-tedavi EB protokolünü tasarlarken amacımız nöronal öncü hücrelerine ESC farklılaşmasını regüle sinyal yollarının in vitro analizini kolaylaştırmak amacıyla nöral farklılaşma optimize etmektir. Bu protokolün avantajlarından biri kolaylaştırılmasıdır immünfloresans. 3D EBS tarafından hücre fonksiyonunun analizi de antikorlar tarafından nüfuz ve nöral farklılaşma odaklı mikroskopi ile immunolabeling ve hücrelerin görüntüleme kolaylaştırır sırasında belirli zaman noktalarında 2D tek tabaka halinde görüntü. EB ayrışma zordur değildir.Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, kemirgen ESC'lennin nöral farklılaşma çalışma için nispeten basit ve erişilebilir bir yöntem sunulmaktadır. Daha önceki protokollarda, RA günde 2 veya EB asılı damla, 8 gün 4 veya süspansiyon kültürü 7 tarafından ortam ilave edildi, EB damla agregasyonu 21 asılı, sırasıyla, ya da hemen sonra. Biz icat Protokolde, RA daha önce eklenmiştir. Süspansiyon kültürü ile oluşturulmuş EBS için RA'nın da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma AH NIH hibe R01 HL119984 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
