Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

CES provengono dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule sono pluripotenti, cioè hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula dell'organismo di origine. ESC differenziazione in vitro è di grande interesse, come un sistema sperimentale per studiare percorsi e meccanismi di sviluppo. Offre un potente e flessibile sistema modello per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici per la correzione della disfunzione delle cellule e dei tessuti. EBs ricapitolano molti aspetti della differenziazione cellulare durante l'embriogenesi precoce. In particolare, EBs possono essere utilizzati quando letalità embrionale rende difficile determinare la base cellulare dei difetti embrionali ^{1, 2.} EBs possono essere formate mediante la goccia sospesa o tecniche sospensione liquida ^3. Il vantaggio del primo è la capacità di generare EBS di dimensioni e densità costante, facilitando così la riproducibilità sperimentale.

<p class = "jove_content"> interazione con proteine ​​di adesione extracellulari della matrice (ECM) può influenzare la motilità e la sopravvivenza delle cellule aderenti. Nel sistema di coltura 2D, fibronectina è spesso applicato per aumentare l'adesione delle cellule al substrato. Fibronectina è un componente lamina basale riconosciuto da 10 tipi di superficie cellulare integrine eterodimeri ^4.

RA è una piccola metabolita della vitamina A lipofilo che induce neurale differenziazione ^{5, 6.} Elevate concentrazioni di RA promuovere genica neurale e reprime l'espressione genica mesoderma durante la formazione EB ^{7, 8.} RA è prodotto da vitamina A ossidazione retinaldehyde da uno o alcol deidrogenasi retinolo, seguita da ossidazione retinaldehyde al prodotto finale retinaldehyde deidrogenasi ^9. differenziazione neurale richiede il trasporto di RA dal citoplasma al nucleo da cellule RA-binding protein 2 (CRABP2). Nel nucleo, RA si lega al suo recettore affine costituito da un eterodimero RAR-RXR ^10. Ciò si traduce nel reclutamento di co-attivatori trascrizionali, e l'inizio della trascrizione ^{9, 11.} Inoltre, RA promuove la degradazione di fosforilato (attivo) SMAD1, contrapponendosi così BMP e SMAD segnalazione ^12. Oltre a queste attività, RA aumenta l'espressione di Pax6, un fattore di trascrizione che supporta neurale differenziazione ^13. Segnalazione RA è modulata da sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleotide adenina nicotinammide nucleare (NAD +) – enzima dipendente che deacetylates CRABP2, interferendo con la sua traslocazione al nucleo, e quindi con RA legame al eterodimero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> Il nostro obiettivo nella progettazione del protocollo EB RA-trattati qui descritto è quello di ottimizzare la differenziazione neuronale al fine di facilitare l'analisi in vitro delle vie di segnalazione che regolano la differenziazione ESC in cellule precursori neuronali. Uno dei vantaggi di questo protocollo è facilitazione l'analisi della funzione delle cellule mediante immunofluorescenza. 3D EBs non sono ben penetrato da anticorpi e sono difficilmente immagine. EB dissociazione in un monostrato 2D in punti temporali specifici durante la differenziazione neuronale facilita immunomarcatura e l'imaging delle cellule mediante microscopia confocale.