Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

1. Подготовить материалы Очистите интересующий белок (см. Раздел 2). Подготовьте или купите G-actin. ПРИМЕЧАНИЕ: G-actin может быть выделен из нескольких источников 1 ; Альтернативно, его можно приобрести. Восстановленный G-актин (в 5 мМ Tris pH 8,0, 0,2 мМ CaCl 2 , 0,2 мМ АТФ (аденозинтрифосфат) и 0,5 мМ дитиотреитол (ДТТ) следует заморозить, хранить при -80 ° C и> 10 мг / мл В небольших (10-20 мкл) аликвотах и ​​оттаивают непосредственно перед использованием. Аликвоты G-actin не следует замораживать. Подготовьте или купите контрольный белок, такой как BSA (см. Шаг 4.4). Приготовьте 10-кратный буфер для полимеризации (200 мМ имидазола с pH 7,0, 1 М KCl, 20 мМ MgCl 2 , 5 мМ АТФ и 10 мМ ЭГТА (этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'- Тетрауксусна кислота)). Сделайте 10-кратный запас и отрегулируйте рН после добавления АТФ, если необходимо. Алиготе (25 мкл полезный объем) и хранить при -80 и #176; С. Готовят 10-кратный реакционный буфер (200 мМ имидазола, рН 7,0, 1,5 М NaCl, 20 мМ MgCl 2 , 5 мМ АТФ и 10 мМ EGTA). Сделайте 10-кратный запас и отрегулируйте рН после добавления АТФ, если необходимо. Аликвоту (50-100 мкл полезный объем) и хранить при -80 ° C. ПРИМЕЧАНИЕ. Состав реакционного буфера является гибким и может потребоваться корректировка для уменьшения фонового осаждения, ограничения неспецифического связывания и / или улучшения связывания (этапы 1.5.1-1.5.3). Отрегулируйте рН буфера реакции между 6 и 8 для оптимизации стабильности белка. При более низком или более высоком рН замените соответствующий буфер для имидазола. ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте рН 7,0 в качестве отправной точки, если для стабильности стабильность белка не требует более низкого или более высокого рН. Не используйте буфер с рН ниже 6,0 или выше 8,0, так как это может нарушить актин. Рекомендуемые буферы (конечная концентрация и оптимальные значения рН) включают: 20 мМ MOPS (3- ( N- морфолино) пропансульфоновая кислота), pH= 6,5; 20 мМ имидазола, pH 7,0; 10 мМ HEPES (4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфокислота), pH 7,5; И 20 мМ Трис, рН = 8,0. Варьируйте концентрацию соли в буфере реакции, в зависимости от потребностей анализа. ПРИМЕЧАНИЕ. Актин является кислотным белком, и почти все связывающие актин белки в некоторой степени зависят от электростатических взаимодействий с ассоциацией с актином. Поэтому увеличение концентрации соли в большинстве случаев приводит к уменьшению связывания актина. Буфер для реакции использует физиологический уровень соли (150 мМ NaCl, рабочая концентрация), и это рекомендуемая исходная точка. Если необходимо, концентрация соли может быть снижена ( например, до 100 мМ) для содействия связыванию или увеличения с целью ограничения связывания. Не изменяйте концентрации MgCl 2 , ATP или EGTA в буфере для реакции, если нет особых причин для этого. 2. Подготовьте тестовый белок к анализу. ДГОБелок высокой чистоты с использованием жидкостной хроматографии для достижения наилучших результатов 7 . ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании рекомбинантного белка следует удалить крупные белковые метки, такие как глутатион-S-трансфераза (GST), путем расщепления протеазой из целевого белка, поскольку они могут препятствовать связыванию. GST также вызывает гомодимеризацию слитых белков, которые могут искусственно увеличить сродство связывания актина. Определить концентрацию белка путем измерения поглощения при 280 нм. Разделите по коэффициенту экстинкции; Коэффициент экстинкции можно вычислить из последовательности белка, используя анализ последовательностей или онлайн-инструменты. В качестве альтернативы, определите концентрацию белка с использованием методов Брэдфорд или BCA (бицинхониновая кислота). ПРИМЕЧАНИЕ. Для начальных экспериментов обычно достаточно 50-100 мкл белка при 20-40 мкМ. Это позволит проанализировать связывание в области низких микромолей, что является хорошей отправной точкой для большинства актин-связывающих белков. Больший квантИ часто требуется более высокая концентрация белка для создания кривой связывания для расчета сродства (см. Раздел 5). Незадолго до употребления тщательно перемешайте белок (50000-100000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С), чтобы удалить агрегаты нерастворимого белка. Если имеет значение растворимость, повторно измерьте концентрацию белка (шаг 2.2) после центрифугирования. 3. Подготовьте F-актин Удалите аликвоту G-actin из морозильника -80 ° C и быстро разморозьте. Добавить 10x полимеризационный буфер к G-актину до конечной концентрации 1x. Убедитесь, что концентрация G-актина в 1х полимеризационном буфере составляет по меньшей мере 10-20 мкМ, значительно выше критической концентрации. Инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), чтобы актин смог полимеризоваться. После полимеризации хранить F-актин в растворе при 4 ° C, где он будет стабильным в течение нескольких недель. Перед повторным использованием F-actin после хранения аккуратно инвертируйтеИли несколько раз пролистайте пробирку, чтобы убедиться, что весь актин растворен и равномерно распределен в растворе. ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Добавить фаллоидин для достижения молярного соотношения G-актин 1: 1: фаллоидин. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре, чтобы фаллоидин мог связываться с F-актином. Фаллоидин стабилизирует F-актин и выполняет две задачи: (i) он уменьшает количество актина, которое не осаждается во время центрифугирования, и (ii) оно позволяет разбавлять F-актин ниже критической концентрации (~ 0,5 мкМ), что часто Необходимо, если изменяют количество F-актина для создания кривой связывания (см. Раздел 5 по измерению сродства). 4. Анализ гранулирования – основной протокол ПРИМЕЧАНИЕ. Основной протокол, описанный в разделе 4, используется для определения того, является ли представляющий интерес белок содовым осаждением с F-актином. Как только связывание с F-актином установлено, аффинность этого взаимодействия может быть измерена по протоколу, описанному в разделе 5. Готовят реакционный буфер в день использования, разбавляя запас 10х до 1х и добавляя DTT до конечной концентрации 1 мМ. ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Добавить полидоканол до конечной рабочей концентрации 0,02% в реакционном буфере. Полидоканол является поверхностно-активным веществом, которое снижает неспецифическое связывание фона и помогает предотвратить прилипание гидрофобных белков к ультрацентрифужной пробирке. Разбавьте интересующий белок до желаемых концентраций в 1х реакционном буфере в ультрацентрифужных пробирках. Следите за низким объемом образца (40-60 мкл), чтобы избежать использования больших количеств белка, используя ультрацентрифужные пробирки с небольшими минимальными объемами ( например , 7 x 20 мм пробирки, каждая из которых содержит по 0,2 мл). ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку многие актин-связывающие белки имеют сродство к F-актину в микромолярном диапазоне, рекомендуется тестировать интересующий белок при 2 и 10 мкМ. Если связывание не наблюдается при 10 мкМ, маловероятно, что связывание будет наблюдаться при более высоких концентрациях. ЕслиДобавленный белок составляет более 10-20% от конечного реакционного объема, может потребоваться диализ белка в реакционный буфер перед проведением эксперимента. Добавить F-actin в желаемую конечную концентрацию. ПРИМЕЧАНИЕ: 2 мкМ является полезной концентрацией для начальных экспериментов, потому что она значительно выше критической концентрации, таким образом поддерживая актин в нитевидном состоянии. Он будет производить видимый осадок при анализе с помощью SDS-PAGE (стадия 4.10). Подготовьте следующие контроли в ультрацентрифужных пробирках, чтобы сделать анализ информативным. Подготовьте образец (ы), содержащий представляющий интерес белок, без F-актина. Убедитесь, что концентрация белка в этих образцах соответствует концентрации в образцах «плюс F-актин». ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы будут определять количество белка, который агрегируется или прилипает к краям трубки ультрацентрифуги в отсутствие F-актина. Подготовка образцов отрицательного контроляПри той же или сходной концентрации (концентрациях), используемой для представляющего интерес белка. Используйте контрольный белок, который не связывается с F-актином, с F-актином и без него. ПРИМЕЧАНИЕ. Это важный контроль, поскольку белки могут попасть в ловушку в филаментах актина и грануле с F-актином, даже если они не связывают F-актин. Количество захвата может варьироваться в зависимости от источника F-актина, условий буфера и т. Д. Таким образом, этот контроль должен быть включен во все эксперименты. В идеале контрольный белок должен иметь молекулярную массу, близкую к интересующему белку ( например , для αE-катенина (~ 100 кДа), BSA (66 кДа) является подходящим контролем). Коммерчески доступные стандарты гель-фильтрации обеспечивают превосходные контрольные белки, поскольку они охватывают диапазон размеров и, как правило, не содержат агрегатов. Необязательно, готовят образцы положительного контроля, содержащие белок, который связывается с F-актином, с F-актином и без него. Убедитесь, что концентрация (концентрации) аналогична концентрацииЕ белка, представляющего интерес. ПРИМЕЧАНИЕ. Этот контроль полезен тем, что он демонстрирует, что экспериментальные условия ( например, приготовленный F-актин, буфер для реакции и центрифугирование) позволяют связывание F-актина. Поскольку анализ на гранулирование может не выявить слабые взаимодействия F-актина (см. Обсуждение), рекомендуется, чтобы известный F-актин-связывающий белок имел умеренно-слабую аффинность к F-актину ( то есть в области низких микромолей ). Очищенные F-актин-связывающие белки являются коммерчески доступными. Инкубируйте все образцы в течение 30 мин при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ. Более длительные сроки инкубации являются точными, предполагая, что представляющий интерес белок является стабильным, хотя, вероятно, и не нужен. Если интересующий белок не устойчив при RT, образцы можно инкубировать при 4 ° C. В этом случае может потребоваться более длительное время инкубации. Загрузите образцы в ротор центрифуги. Расположите трубы внутри ротора, чтобы помочь в ресуспендировании осадка после центрифугирования.Для этого отметьте все пробирки центрифуги ( например, с номером образца) и поместите все трубы в роторе в одно и то же положение ( например, номер обращен наружу). Центрифуга при 100000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С в ультрацентрифуге. После центрифугирования удаляют 3/4 надосадочной жидкости ( например , 45 мкл, если начальный объем составляет 60 мкл) из каждой пробирки и смешивают с 1/3 объема 4х буфера для образца (15 мкл в данном случае) в отдельной микроцентрифужной пробирке. Удалите оставшийся супернатант с наконечником для загрузки геля, стараясь не нарушать гранулу (которая может быть видна как стеклянное пятно). ПРИМЕЧАНИЕ. Важно удалить супернатант из пробирок как можно скорее после завершения центрифугирования, чтобы ограничить диссоциацию белка после разделения. Кроме того, не мойте гранулы буфером для реагентов по той же причине. Добавьте 4/3 тома 1x буфера выборки для каждого pelleТ ( например , 80 мкл, если начальный объем составлял 60 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ. Это делает разбавление таким же, как и для надосадочной жидкости (стадия 4.8, добавляли 1/3 объема 4х буфера для образцов), что позволяет прямое сравнение между образцами осадка и супернатанта и определение процента белка, который был осажден. Добавить буфер для образца во все пробирки и инкубировать в течение не менее 5 мин при комнатной температуре. Позвольте грану сидеть в буфере для образцов, чтобы улучшить восстановление образца. Растирайте образец 8-10 раз с помощью наконечника пипетки p200 для ресуспендирования осадка путем непрерывной промывки области таблетки в пробирке. Аккуратно очистите наконечник пипетки от гранул во время растирания, чтобы помочь при ресуспензии. ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в пробу во время растирания, так как это приведет к образованию пузырьков проб и уменьшению восстановления образца. Перенесите ресуспендированные образцы в микроцентрифужные пробирки после растирания. </ Ол> Анализ супернатантов и образцов гранул с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси 8 путем загрузки 10-15 мкл образца на дорожку; Этого достаточно для визуализации белков. ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, которые осаждаются совместно с F-актином, будут обогащаться в образцах гранул «плюс F-актин» над образцами гранул «без F-актина» ( рисунок 1A ). Стандартное окрашивание кумасси синим является достаточным для обнаружения, если концентрации белка находятся в диапазоне 0,1-10 мкМ. Коллоидная кумасси 9 или вестерн-блоттинга могут быть использованы для повышения чувствительности, если концентрации более низких белков используются для измерения взаимодействий с большей аффинностью. Изображение Гели, окрашенные кумасси, с использованием сканера или системы визуализации (шаг 5.12). 5. Анализ гранулирования – количественная оценка Примечание: если наблюдается специфическое связывание с F-актином, может быть полезно измерить сродство tВзаимодействия. Это достигается путем внесения нескольких изменений и дополнений в протокол, описанный в разделе 4. За отличным руководством по проектированию и интерпретации тестов на связывание см. Pollard 10 . Для помощи в анализе и количественном анализе приводится блок-схема ( рисунок 2 ). Определите диапазон концентраций для проверки. ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон концентраций будет зависеть от белка и должен простираться от концентрации ниже кажущегося K d ( например, 1 мкМ) до концентраций, достаточно высоких, чтобы насытить связывание. Очень важно, чтобы связывание достигало насыщения в нескольких образцах в верхнем пределе диапазона концентраций, чтобы сформировать точную кривую связывания ( рис. 1С ). Как отмечено выше, многие актин-связывающие белки имеют сродство к F-актину в низкомикромолярном диапазоне (1-5 мкМ). Для белка с K d 0,5-1 мкМ полезный начальный диапазон концентраций должен составлять 0,1-10 мкМ. Жесткий отжиг (шаг 2.3) представляющий интерес белок для удаления агрегатов. Серийно разбавляют белок, чтобы получить концентрационный ряд, содержащий 7-8 образцов при 2х конечной концентрации, подлежащей тестированию. Например, если диапазон для тестирования составляет 0,1-8 мкМ, подготовьте следующие разведения в 1х реакционном буфере: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,2 мкМ. ПРИМЕЧАНИЕ. Как упомянуто на этапе 4.2, если добавленный белок составляет более 10-20% от первого разведения (образец 16 мкМ в примере выше), может потребоваться либо концентрировать белок дальше, либо диализировать Белка в 1х реакционный буфер. Обязательно подготовьте достаточное количество каждого разведения для образцов «плюс F-actin» и «no F-actin». Подготовьте образцы (как в разделе 4), разбавив интересующий белок до желаемых концентраций в 1х буфере для реакции в ультрацентрифужных пробирках. Следите за тем, чтобы объем образца не был низким (40-60 мкл), чтобы избежать использования больших количеств белка с использованием ультрацентраПробирки с небольшими минимальными объемами ( например , 7 x 20-миллиметровые пробирки, каждая из которых содержит по 0,2 мл). Добавить F-actin в желаемую конечную концентрацию к соответствующим образцам и поднять объем, используя 1x реакционный буфер. Например, для 50 мкл реакций с использованием 2 мкМ F-актина убедитесь, что каждый образец имеет 25 мкл 2х белков, 10 мкл 10 мкМ F-актина и 15 мкл 1х реакционного буфера. Включите контрольные образцы (шаги 4.4.2 и 4.4.3). ПРИМЕЧАНИЕ. Для отрицательных и положительных контролей используйте одну концентрацию в пределах проверяемого диапазона (шаг 5.1), идеально около середины до верхней границы диапазона ( например, 4 мкМ, если диапазон концентраций составляет 0,1-10 мкМ). Инкубируйте все образцы в течение 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин удаляют 1/5 каждого образца ( например, 10 мкл 50 мкл реакции) и смешивают с 20 мкл воды и 10 мкл 4х буфера для образцов. ПРИМЕЧАНИЕ. Это «Total»Amples и будет использоваться для создания стандартной кривой. Загрузите образцы в ротор ультрацентрифуги. Центрифуга в течение 20 мин при 100000 xg и 4 ° C. По желанию после центрифугирования удаляют 3/4 надосадочной жидкости ( например, 30 мкл, если центрифугированный объем составляет 40 мкл) из каждой пробирки и смешивают с 4х буфером для проб (в данном случае 10 мкл) в отдельной микроцентрифужной пробирке. Удалите оставшийся супернатант с наконечником для загрузки геля, стараясь не мешать грануле. ПРИМЕЧАНИЕ. При измерении аффинности связывания нет необходимости запускать супернатант. Тем не менее, может быть полезно сохранить супернатант, особенно при тестировании нового белка. Удалите супернатант, если не анализируете (шаг 5.7). Ресуспендируют осадок в 1 объем 1х буфера для образца ( например, 40 мкл, если объем центрифугирования составляет 40 мкл). Добавить буфер для образца во все пробирки и инкубировать в течение не менее 5 мин при комнатной температуре. TrПовторяют образец 8-10 раз с наконечником пипетки p200, непрерывно промывая область шарика трубки. Аккуратно очистите наконечник пипетки от гранул во время растирания, чтобы помочь при ресуспензии. Перенесите ресуспендированный белок в микроцентрифужную пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ. Это образцы «Пелле». Проанализируйте образцы Total и Pellet с помощью SDS-PAGE 8 . Запускайте все образцы на один гель, если это возможно; Если нет, запустите образцы гранул на один гель и на второй образец. ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая количество образцов, рекомендуется большая система геля для анализа. При работе с образцами на двух или более гелях важно, чтобы все гели окрашивались одинаково ( то есть, тот же раствор Кумасси и то же время , что и для окрашивания / удаления). Изображение Кумасси-окрашенные гели с использованием системы формирования изображений, которая измеряет интенсивности белковых полос в широком ( т. Е. В два-три логарифма) и линейном диапазоне. Убедитесь, что изображенияСобранные без насыщенных пикселей. ПРИМЕЧАНИЕ. Системы формирования изображений на основе лазера обеспечивают наилучшую чувствительность и отношение сигнал / шум. Используя ImageJ или аналогичную программу анализа, измерьте интенсивности полосы белка и вычислите количество связанного белка. ПРИМЕЧАНИЕ. Для всех измерений образца используйте инструмент выбора в ImageJ, чтобы нарисовать область интереса (ROI) вокруг каждой полосы и измерить (проанализировать> измерить) область и среднее значение серого. Вычислите фон для каждого геля, измеряя среднее значение серого из области без образца. Вычтите среднее значение среднего значения серого из каждого значения ROI, обозначающее значение серого, а затем умножьте на площадь, чтобы получить интегрированное значение плотности для каждой полосы. Измерьте интенсивность протеинового белка по процентам от Всего образцов ( Рисунок 2A ). Создайте стандартную кривую, построив график интенсивности полосы ( т. Е. Интегральных измерений плотности) по сравнению с массой белка ( рис.2В). Измерьте количество представляющего интерес белка, который был осажден с помощью F-actin (соосажденный белок, рисунок 2C ). Измерьте количество интересующего белка, осаждаемого в отсутствие F-актина (фоновая седиментация, рисунок 2D ). Вычтите фон седиментации из co-sedimented белка ( т. Е. Вычесть значения из шага 5.13.4 из шага 5.13.3), чтобы определить количество белка, который связан с F-актин. Измерьте количество F-актина в каждой таблетке ( рисунок 2E ). Определите среднее количество F-актина на образец, а затем разделите каждую выборку на среднее значение, чтобы определить отношение F-актина в каждой выборке относительно среднего ( т. Е. Числа под полосами). Для каждого образца разделите количество связанного белка (рассчитанное на этапе 5.13.5) с отношением гранул актина в отношении F-актина (шаг 5.13.6), чтобы скорректировать различия в таблетке. NОТЕ: Это значение является нормированным связанным белком. Используйте стандартную кривую (шаг 5.13.2), чтобы вычислить количество (массу) нормированного связанного белка (шаг 5.13.7) в каждом образце. ПРИМЕЧАНИЕ: первоначально удаленный белок (образец «Всего»), а также загруженное количество (которое, если только весь осадок не был загружен, будет составлять некоторую долю осадка), должно учитываться при расчете общего количества белка Что гранулированный. Определите концентрацию связанного белка в каждом образце из общей массы белка в грануле (рассчитанной на этапе 5.13.8) и объема образца. Вычтите это значение из начальной концентрации для определения количества свободного белка. Разделите концентрацию связанного белка на концентрацию актина (мкМ / мкМ актина) и постройте график зависимости от концентрации свободного белка для получения кривой связывания ( рис. 1С ). ПРИМЕЧАНИЕ: Так как F-актин не является единым, однородным видом, он является труднымКульт для экстраполяции молярной концентрации F-актина из концентрации G-актина. Используйте начальную концентрацию G-актина для определения количества связанного белка (мкМ / мкМ актина) и оценки кажущейся концентрации сайтов связывания в реакции. Концентрация сайтов связывания обычно меньше, чем концентрация актиновых мономеров в реакции, потому что не все актины полимеризуются и потому, что одна молекула связывающего актин белка может контактировать с несколькими мономерами на актиновой нити. Используя статистическую программу, определите сродство (K d ) и B max по кривой связывания с использованием нелинейной регрессии по методу наименьших квадратов. ПРИМЕЧАНИЕ. Участки Scatchard не рекомендуется анализировать данные привязки, отчасти потому, что они могут затуманить, насколько насыщен связывание, и потому, что они могут искажать экспериментальную ошибку 10 .