Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians
Summary
Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.
Abstract
In de studie van volwassen stamcellen en regeneratieve mechanismen, planarian platwormen zijn een nietje in vivo modelsysteem. Dit is grotendeels te danken aan hun overvloedige pluripotente stamcellen bevolking en het vermogen om alle cellen en weefsels types na verwondingen die katastrofisch voor de meeste dieren zou regenereren. Onlangs hebben planarians populairder geworden als een model voor oog regeneratie. Hun vermogen om het gehele oog regenereren (bestaande uit twee weefseltypen: pigmentcellen en fotoreceptoren) maakt de dissectie van de mechanismen reguleren visuele systeem regeneratie. ablatie oog heeft verschillende voordelen boven andere technieken (zoals onthoofding of gaten) voor de behandeling oogspecifieke pathways en mechanismen, de belangrijkste daarvan is dat regeneratie grotendeels beperkt tot alleen oogweefsels. Het doel van deze video artikel is om te demonstreren hoe de planarian optische kop op betrouwbare wijze te verwijderen zonder de hersenen verstoren of de omliggende weefsels.De behandeling van wormen en het onderhoud van een gevestigde kolonie wordt ook beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een 31 G 5/16 inch insuline naald operatief schep de optische kop planarians geïmmobiliseerd op een koude plaat. Deze werkwijze omvat zowel enkele als dubbele oog ablatie, met de ogen regenereren binnen 1-2 weken, waardoor een groot aantal toepassingen. In het bijzonder kan deze ablatietechniek goed te combineren met farmacologische en genetische (RNA interferentie) schermen voor een beter begrip van regeneratieve mechanismen en hun evolutie, oog stamcellen en hun onderhoud en phototaxic gedragsreacties en de neurologische basis.
Introduction
Planarians een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van volwassen stamcellen celgemedieerde regeneratie. Deze niet-parasitaire zoetwater platwormen bezitten het vermogen om alle ontbrekende weefsels, waaronder het centrale zenuwstelsel en de hersenen 1 regenereren. Bestudeerde al in 1700 2, technologische ontwikkelingen op het gebied planarian de afgelopen 10-15 jaar (zoals een gesequenced genoom, in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA interferentie (RNAi) en transcriptomics) hebben deze historische modelorganisme bijgewerkt . In het bijzonder, hebben planarians onlangs steeds populairder geworden als een opkomend model voor oog onderzoek 3.
Planarians hebben prototypische ogen met twee weefseltypen de fotoreceptor neuronen en pigmentcellen; Dit is de karakterisering van zijn oog stamcellen populatie ingeschakeld en toonden dat veel van de genen die de vertebrate eyekeling zijn geconserveerd in planarians 4, 5. De optische bekers dorsaal gelegen en uit de witte, ongepigmenteerde dendrieten van de fotoreceptor neuronen en halve maanvormige zwarte pigmentcellen en de ogen innerveren de hersenen via een optische opticum. Naast het feit dat een model voor het ophelderen van regeneratieve processen 6, planarian het oog is geschikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van automomous 7, gedragsreacties licht (planarians weer negatief phototaxis) 8 en de neurologische basis van het gedrag 9.
Eye regeneratie planarians is grotendeels bestudeerd in twee situaties: in het kader van kopregeneratie onthoofding na 4, 10, en na excisie van alleen de oogweefsels 11, 12 </sup>. De meeste planarian studies op het oog van de regeneratie hebben de onthoofding methode, want het is eenvoudig en ongecompliceerd. De meest voorkomende planarian oog excisie methode tot nu toe was verbindingsgat buisje met een fijne glazen capillaire buis 13, 14, hoewel sommige studies hebben ook uitgevoerd amputaties net achter de ogen (gedeeltelijke onthoofding) 15. Echter, al deze methoden omvatten het verlies van andere dan alleen het oog vele weefsels (zoals de hersenen, darmen, en nephridia), potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Het oog ablatie protocol hier gepresenteerde beperkt excisie aan de oogweefsels (met uitzondering van met hersenen), wat resulteert in gegevens die specifieker zijn voor het oog. Bovendien, in tegenstelling onthoofd wormen die 7-14 dagen om voeding te beginnen, zal Eye weggenomen wormen voeden binnen 24 uur ablatie 12, waardoor RNAi experimenten (waar RNAi via voedsel wordt geleverd) wordt performed gelijktijdig.
Hoewel oog ablatie is technisch moeilijker om met succes uit te voeren dan onthoofding, hebben de huidige studies met oog uitsnijding niet inbegrepen gedetailleerde instructies over hun procedures. Het doel van deze video artikel is onderzoekers in staat te stellen de planarian optische kop consequent te verwijderen zonder de onderliggende hersenweefsel en het verwijderen van zo weinig andere weefsels mogelijk te maken. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor zowel enkele als dubbele oog ablatie en is toepasbaar op een groot aantal onderzoeken. Zoals de meeste regeneratie testen oog wordt ablatie goed geschikt voor combinatie met zowel farmacologische en genetische (RNAi) schermen en gedragsonderzoek. Hier beschrijven we methoden voor de behandeling van wormen, het handhaven van een planarian kolonie, en het oog ablatie techniek zelf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit oog ablatietechniek verbetert de huidige methoden (bijvoorbeeld gaten) door het uitsluiten hersenweefsels en beperken excisie voornamelijk aan de oogweefsels. Met de praktijk, kan deze techniek worden uitgevoerd door de meeste mensen, van technici met ervaring in microsurgeries te onervaren maar gewetensvolle undergraduate studenten. Aanbevolen wordt deze techniek vele malen worden uitgevoerd voor het gebruik in ablaties experimenten, waaronder (indien mogelijk) is bevestigd door volledige verwijdering van alle oogw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Michelle Deochand bedanken voor het perfectioneren van dit oog ablatie techniek, Taylor Birkholz voor hulp met de functionele assay, Michael Levin voor de anti-arrestin antilichaam en Junji Morokuma voor informatie over de Peltier platen. Dit werk werd ondersteund door een SFSA subsidie van Western Michigan University te WSB.
Materials
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
References
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B., Tsonis, P. A. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. , 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226 (2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708 (2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76 (2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado, ., A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45 (2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2 (2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8 (2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
