الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات
Summary
يظهر هذا البروتوكول كيفية استئصال باستمرار عيون مستورقة (أكواب البصرية) من دون إزعاج الأنسجة المحيطة بها. باستخدام إبرة الأنسولين والمحاقن، إما احدة أو كلتا العينين يمكن أن يكون ذاب لتسهيل التحقيقات في آليات تنظيم التجديد العين، وتطور تجديد البصري، والأساس العصبي للسلوك الناجم عن الضوء.
Abstract
في دراسة الخلايا الجذعية للبالغين وآليات التجدد، الديدان المفلطحة مستورقة هي من دعائم النظام في نموذج الجسم الحي. ومن المقرر في جزء كبير منه إلى وفرة المحفزة السكان الخلايا الجذعية وقدرتها على تجديد جميع أنواع الخلايا والأنسجة بعد الإصابات التي سيكون كارثيا بالنسبة لمعظم الحيوانات هذا. في الآونة الأخيرة، اكتسبت شعبية مستورقات كنموذج للتجديد العين. قدرتها على التجدد العين بأكملها (تتألف من أنواع الأنسجة هما: الخلايا الصبغية ومبصرات) تسمح للتشريح الآليات التي تنظم تجديد النظام البصري. العين الاجتثاث لديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من التقنيات (مثل قطع الرأس أو ثقب) لدراسة سبل وآليات العين محددة، وأهمها هو أن يقتصر التجديد إلى حد كبير إلى أنسجة العين وحدها. والغرض من هذه المقالة الفيديو هو إظهار كيفية إزالة موثوق الكأس البصرية مستورقة دون إزعاج الدماغ أو الأنسجة المحيطة بها.يوصف أيضا التعامل مع الديدان وصيانة مستعمرة أنشئت. ويستخدم هذا الأسلوب 31 G، 5/16 بوصة الانسولين إبرة لحلج القطن جراحيا من الكأس البصري من مستورقات يجمد على طبق من ذهب الباردة. ويشمل هذا الأسلوب على حد سواء مفردة ومزدوجة الاجتثاث العين، مع عيون تجديد في غضون 1-2 أسابيع، والسماح لمجموعة واسعة من التطبيقات. على وجه الخصوص، هذه التقنية الاجتثاث يمكن الجمع بسهولة مع (التدخل RNA) شاشات الدوائية والجينية لفهم أفضل للآليات التجدد وتطورها، والخلايا الجذعية العين وصيانتها، والاستجابات السلوكية phototaxic وأساسها العصبية.
Introduction
مستورقات هي قوية نموذج حي لدراسة الجذعية البالغة تجديد بوساطة الخلايا. هذه الديدان المفلطحة المياه العذبة غير الطفيلية تمتلك القدرة على التجدد أي وجميع الأنسجة المفقودة، بما في ذلك نظامهم العصبي المركزي والدماغ 1. درس بقدر ما يعود إلى 1700s في 2، والتقدم التكنولوجي في مجال مستورقة خلال 10-15 سنة الماضية (مثل تسلسل الجينوم، في الموقع التهجين، المناعية، والتدخل RNA (رني)، وtranscriptomics) قمنا بتحديث هذا نموذج حي تاريخي . على وجه التحديد، اكتسبت مستورقات شعبية في الآونة الأخيرة لتكون نموذجا الناشئة للبحوث العين 3.
مستورقات لها عيون prototypic مع أنواع الأنسجة اثنين فقط، والخلايا العصبية مستقبلة للضوء والخلايا الصبغية. وقد مكن هذا التوصيف من سكان العين الخلايا الجذعية، وأظهرت أن العديد من نفس الجينات التي تنظم الفقاريات العين دييتم حفظها velopment في مستورقات 4 و 5. تقع الكؤوس البصرية ظهريا وتتكون من البيض، التشعبات unpigmented من الخلايا العصبية مستقبلة للضوء وشبه القمر الخلايا الصبغية الأسود، وعيون عصب الدماغ عن طريق chiasm البصرية. بالإضافة إلى كونه نموذجا لتوضيح عمليات التجدد 6، والعين مستورقة هي مناسبة تماما لدراسة تطور آليات البصرية 7، والاستجابات السلوكية للضوء (مستورقات عرض انجذاب ضوئي سلبي) 8، والأساس العصبي للسلوك 9.
تجديد العين في مستورقات وقد درست إلى حد كبير في سياقين رئيسيين: كجزء من تجديد رئيس يلي قطع الرأس 4، 10، وفيما يلي استئصال فقط أنسجة العين 11 و 12 </سوب>. وقد استخدمت معظم الدراسات مستورقة على تجديد العين طريقة قطع الرأس، كما هو بسيط ومباشر. وكان مستورقة طريقة الختان العين الأكثر شيوعا حتى الآن عبر ثقب مع كوب غرامة الشعرية أنبوب 13 و 14، على الرغم من أن بعض الدراسات قد أجريت أيضا عمليات البتر خلف العينين (قطع الرأس الجزئي) 15. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب تنطوي على فقدان العديد من الأنسجة الأخرى من مجرد العين (مثل الدماغ والأمعاء وnephridia)، ويحتمل أن تعقيد تفسير النتائج. بروتوكول الاجتثاث العين المعروضة هنا يقيد الختان إلى أنسجة العين (باستثناء المخ على وجه التحديد)، مما أدى إلى البيانات التي هي أكثر تحديدا للعين. بالإضافة إلى ذلك، على عكس الديدان مقطوعة الرأس التي تأخذ 7-14 أيام للبدء في التغذية، والعين ذاب الديدان تتغذى خلال 24 ساعة من الاجتثاث 12، مما يسمح للتجارب رني (حيث يتم تسليم رني عبر الطعام) ليتم performeد متزامن.
وعلى الرغم من الاجتثاث العين هو أصعب من الناحية الفنية لأداء بنجاح من قطع الرأس، لم شملت الدراسات الحالية التي تنطوي على استئصال العين تعليمات مفصلة حول إجراءاتها. والهدف من هذه المقالة الفيديو هو لتمكين الباحثين من إزالة باستمرار الكأس البصرية مستورقة دون إزعاج أنسجة المخ الأساسية وإزالة بعض الأنسجة الأخرى كما ممكن. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في كل من مفردة ومزدوجة الاجتثاث العين وينطبق على مجموعة واسعة من التحقيقات. مثل معظم فحوصات تجديد، والاجتثاث العين مناسبة تماما للمزيج مع كل من (رني) شاشات الدوائية والوراثية، وكذلك الدراسات السلوكية. نحن هنا وصف الطرق لمعالجة الديدان، والحفاظ على مستعمرة مستورقة، وتقنية الاجتثاث العين نفسها.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحسن هذه التقنية الاجتثاث العين على الطرق الحالية (مثل ثقب) باستبعاد أنسجة المخ وتقييد الختان أساسا إلى أنسجة العين. مع الممارسة، وهذه التقنية يمكن أن يقوم بها معظم الأفراد، من الفنيين ذوي الخبرة في microsurgeries للطلاب الجامعيين عديم الخبرة ولكن الضميري. فمن المستحسن أن ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ميشيل ديوتشاند لاتقان هذه التقنية الاجتثاث العين، تايلور بيركولز للمساعدة في فحص وظيفي، مايكل ليفين عن الأجسام المضادة لمكافحة arrestin، وجونجي Morokuma للحصول على معلومات على لوحات بلتيير. وأيد هذا العمل من منحة SFSA من جامعة ميشيغان الغربية إلى WSB.
Materials
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 Gallon" box (net weight 3 lbs) |
| Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 filter paper | Sigma | WHA1002125 | Circles, 125 mm diameter, white |
| Easy Touch Insulin syringe (with needle) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 x 15 mm |
| 60 mm Petri dish | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, straight tip , 11 cm |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile |
| Parafilm M paraffin film | Brand | 701606 | 4 in x 125 ft roll |
| 12-well untreated tissue culture plate | VWR | 15705-059 | Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand |
| Plastic food containers (for colony) | Ziploc | Large rectangle | 2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals. |
| Brown paper towels | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED |
| Wash bottle (for worm water), optional | VWR | 16650-275 | Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL |
| Anti-synapsin antibody, optional | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Anti-arrestin antibody, optional | n/a | n/a | Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University |
| Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers |
| Custom Peltier plate, optional | Williams Machine, Foxboro, MA | n/a | Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University: Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate. |
| DC power source (for Peltier plate), optional | B & K Precision | 1665 | Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps. |
| Other common supplies | |||
| Gloves | |||
| Razor blade | |||
| Scissors | |||
| Dissecting scope with gooseneck lighting | |||
| Chopstick rests, optional |
References
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B., Tsonis, P. A. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. , 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226 (2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708 (2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76 (2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado, ., A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45 (2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2 (2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8 (2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
