Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento
Summary
La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.
Abstract
El desarrollo de herramientas de edición de genoma programables ha facilitado el uso de genética inversa para entender los papeles secuencias genómicas específicas juegan en el funcionamiento de células y organismos enteros. Esta causa ha sido enormemente ayudado por la reciente introducción de la CRISPR / sistema de un Cas9 herramienta versátil que permite a los investigadores manipular el genoma y transcriptoma con el fin de, entre otras cosas, knock out, derribar, o golpeen en los genes de forma focalizada manera. A los efectos de la anulación de un gen, CRISPR / Cas9 mediada por roturas de la doble hebra reclutan la vía de reparación del DNA unión de los extremos no homóloga para introducir la inserción o deleción que causan desplazamiento del marco de los nucleótidos en el sitio de ruptura. Sin embargo, un ARN guía individual puede causar indeseables efectos fuera de objetivo, y para descartar éstos hacia fuera, el uso de múltiples guía RNAs es necesaria. Esta multiplicidad de objetivos también significa que se requiere una selección de alto volumen de clones, que a su vez plantea la utilización de un efciente técnica de alto rendimiento para determinar el genotipo de los clones de final. técnicas de genotipificación actuales o bien sufren de limitaciones inherentes o incurren en altos costos, por lo tanto haciéndolos inadecuados para fines de alto rendimiento. Aquí, nos detalle el protocolo para el uso de fluorescente PCR, que utiliza ADN genómico a partir de lisado celular bruto como una plantilla y, a continuación, la solución de los fragmentos de PCR a través de electroforesis en gel capilar. Esta técnica es lo suficientemente precisa para diferenciar diferencia de un par de bases entre los fragmentos y por lo tanto es adecuada para indicar la presencia o ausencia de un desplazamiento de marco en la secuencia codificadora del gen diana. Este conocimiento preciso impide de hecho la necesidad de una etapa de secuenciación confirmatoria y permite a los usuarios ahorrar tiempo y costes en el proceso. Además, esta técnica ha demostrado ser versátil en el genotipado de diversas células de mamíferos de diversos orígenes tisulares dirigidas por ARN de guía contra numerosos genes, como se muestra aquí y en otros lugares.
Introduction
enfoques de genética inversa han permitido a los científicos para dilucidar los efectos de alteraciones específicas en el genoma de la célula u organismo completo. Por ejemplo, la expresión de un gen particular puede ser atenuada por el gen knockdown 1, 2 (reducción parcial) o knockout del gen 3, 4 (ablación completa) con el fin de determinar el efecto que esto tiene sobre la función de la célula o en el desarrollo del organismo.
experimentos de eliminación de genes se han convertido en más fácil desde la introducción de nucleasas programables específicos de secuencia, tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas efectoras del tipo activador de transcripción (Talens). Sin embargo, la relativamente reciente caracterización de la CLUSTERED intercalados regularmente de repetición corta capicúa (CRISPR) / sistema de Cas9 ha hecho que sea extremadamente fácil para cualquier laboratorio en todo el mundo para llevar a cabo Genknockout experimentos e. En esencia, el sistema / Cas9 CRISPR consta de dos componentes esenciales: un guía única de ARN (sgRNA), que reconoce y se une a través de complementariedad de bases a una secuencia específica en el genoma, y una endonucleasa llamada Cas9. Las secuelas de la acción de unión y específica del complejo sgRNA-Cas9 en el ADN genómico es la rotura de la doble cadena de ADN. Esto, a su vez, desencadena el mecanismo de respuesta al daño del ADN en la célula, que se repara posteriormente a través de las vías (HR) de extremos no homólogos de unión (NHEJ) o de la recombinación homóloga. Dado que el mecanismo NHEJ de reparación (pero no el mecanismo HR) a menudo resulta en la inserción aleatoria o deleción de nucleótidos en el sitio de reparación, lo que resulta en la inserción / deleción mutaciones (indel), puede provocar que el marco de lectura de un exón se desplace. Esto puede entonces dar lugar a la knockout del gen debido a la terminación prematura de la traducción y la descomposición mediada por el antisentido 5, 6,7.
A pesar de la conveniencia proporcionada por la introducción del sistema / Cas9 CRISPR en la anulación de un gen, la determinación del genotipo de los clones de células diana sigue siendo un cuello de botella, especialmente en un entorno de 8, 9 de alto rendimiento. Las técnicas existentes o bien sufren importantes limitaciones inherentes o son económicamente costosa. Por ejemplo, el ensayo inspector o T7E1, que es un ensayo enzimático que detecta desajustes en el ADN dúplex 10, no es capaz de distinguir entre los clones de tipo silvestre y mutantes homocigotos (clones cuyos alelos están mutados de forma idéntica), ya que estos clones tienen alelos idénticos y por lo tanto no presentan desajustes en su secuencia de ADN 11. Además, el uso de la secuenciación de Sanger, que se considera el estándar de oro en el genotipo de los clones mutantes, en una configuración de alto rendimiento no es deseable debido a su alto coste. A continuación, presentamos un detprotocolo ailed de la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente, que pueden sustraerse a las limitaciones de las otras técnicas de genotipificación existentes y es particularmente útil en la realización de una pantalla de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Este método es técnicamente sencillo de realizar y permite ahorrar tiempo y costes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La anulación de un gen específico en una línea celular modelo de elección se ha convertido en rutina para dilucidar el papel que desempeña el gen en ese contexto celular particular. De hecho, varias pantallas de todo el genoma están actualmente disponibles que utilizan el sistema CRISPR / Cas9 para apuntar genes humanos prácticamente todos los conocidos en el genoma de 14, 15, 16. Con estas pantallas de gran escala (o in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Sra. Tan Shi Min, Sra. Helen Ong, y el Dr. Zhao Yi para ayudar con los experimentos de electroforesis capilar en gel. Este trabajo fue apoyado por NMRC / IRG conceder NMRC / 1314/2011 y el Ministerio de Educación ACRF Nivel 2 subvención del Fondo MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O’Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
