Mehrschicht-Cortical Ca²⁺ Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

Verfahren, die Tierfächer betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei LifeSource Biomedical Services, dem NASA Ames Research Center, Kalifornien, genehmigt. 1. Vorbereitende Vorbereitung Sterilisieren Sie die Werkzeuge, die in chirurgischen Eingriffen in einem heißen Wulst-Sterilisator verwendet werden sollen, und wischen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol ab. Schalten Sie das Heizkissen über die stereotaxische Bühne und halten Sie es bei 37 ° C. Anästhesieren des Tieres mit Isofluran (5% für Induktion und 1-2% für die Instandhaltung, 0,6-0,8 L / min O 2 ). Überprüfen Sie die Abwesenheit eines Zehen-Quetsch-Reflexes, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen. Montiere das Tier in einem stereotaxischen Rahmen mit Ohr- und Zahnstangen. Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen des Tieres und decken sie mit einem Stück dunkles Papier ab, um sie vor dem Trocknen und intensiven chirurgischen Lichtern zu schützen. Subkutan injizieren das Tier mit Ketoprofen (2.5Mg / kg) oder Carprofen (2,5 mg / kg) 2. Virus-Injektions-Chirurgie Trimmen und rasieren Sie die Kopfhaut zwischen den Augen und Ohren und desinfizieren Sie die Haut mit 3 alternativen Tupfern von 70% Ethanol und Betadin. Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie einen Einschnitt in die Kopfhaut, beginnend zwischen den Augen und verlängern 1,5 cm rostrocaudal mit einer sterilen chirurgischen Klinge. Öffnen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen, und entfernen Sie das Periost um die gewünschte Injektionsstelle mit Wattestäbchen und einem Skalpell. Spritzen Sie den Schädel mit sterilem PBS. Den Schädel mit Wattestäbchen reinigen und polieren. Nimm den Schädel und markiere mit einer Markierung die stereotaktischen Koordinaten für die Virusinjektion. Mit einem 0,5 mm Grat auf einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer (auf ca. 7.000-10.000 U / min), schaffen Sie ein kleines Loch im Schädel. Tragen Sie leichten Druck während des Bohrens und intermittierend reinigen Sie den Knochenstaub und befeuchten Sie den Bereich mit sterilen PBS, um zu verhindern, dass Gehirngewebe überhitzt, bis die Hirnoberfläche re istSchmerzte Halten Sie das Gehirn feucht, wo das Loch gebohrt wird. Benutze eine 26 G-Nadel zum Aufnehmen von Viren ( zB AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) in der Mikrospritze und ersetze sie dann durch eine 35 G-Nadel zur Injektion. Befestigen Sie die mit Virus beladene Mikrospritze an den Manipulatorarm des Stereotaxikapparates. Bringen Sie die Spritze in die Nähe der Einspritzstelle und stellen Sie den Winkel der Nadel so ein, dass sie in einem 90 ° -Winkel zur Gehirnoberfläche eintritt. Senken Sie die Nadel, bis sie pia mater berührt und durch die Dura durchbohren. Beginnen Sie, die Nadel in Schritten von 10 μm / s zu senken, bis sie die gewünschte Tiefe (z) erreicht. Fixieren Sie die Nadel Platz dort mit dem stereotaxischen Arm. Stellen Sie die Mikrospritzenpumpe ein, um 250 nL Virus mit 25 nL / min zu injizieren. Kritischer Schritt: Da das zu injizierende Virusvolumen vom Titer und der Verdünnung abhängt, führen Sie im Laufe der Verdünnungsexperimente optimale Volumen- und Konzentrationskriterien für bildgebende Zellen einIm experiment Wenn manche Viren aus der Injektionsstelle ausströmen, pausieren Sie die Injektion und warten, bis das Hirngewebe den Virusstropfen aufnimmt. Warten Sie 5-7 Minuten, nachdem das Gesamtvolumen gespritzt wurde, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Farbstoffe wie schnelles Grün könnten auch der Viruslösung zugesetzt werden, um zu helfen, die Injektionsrate zu kontrollieren, falls das Virus aus der Hirnoberfläche austritt. Für die Etikettierung mehrerer Schichten in Kortex, verwenden Sie mehrere Injektionen, wenn nötig. Starten Sie an der ventralsten Stelle zuerst und warten 5-7 min nach der Injektion und ziehen Sie die Nadel zum nächsten dorsalen Punkt für die Injektion ( z. B. Injektion bei -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML und 400 und 600 μm DV). Warten Sie 10 Minuten nach der letzten Injektion, bevor Sie die Nadel herausziehen und entfernen Sie sie aus dem stereotaxischen Setup. Mischen Sie eine kleine Menge eines in vivo biokompatiblen transparenten Elastomer-Klebstoffs aus der Doppel-Fass-Spritze (ZB Kwik-Sil) und decke das Loch im Schädel damit ab. Tragen Sie Cyanoacrylat-Klebstoff auf die Schicht aus Elastomer-Kleber und lassen Sie es heilen. Naht die Kopfhaut und lässt das Tier von der Anästhesie in einem warmen Erholungskäfig erholen, bis es ambulant ist. Verabreichen Sie Ketoprofen (2,5 mg / kg) oder Carprofen (2,5 mg / kg) subkutan, bevor Sie das Tier in den Hauskäfig zurückbringen. Singly Haus Post-Chirurgie Themen, um die Chirurgie Website zu schützen und wiederholen Sie die Dosis 24 Stunden später. Nach dem Entfernen der Mikrospritze, spülen Sie beide 26 G und 35 G Nadeln 7-10 mal mit destilliertem Wasser, um vor der Lagerung zu reinigen. 3. Prisma-Implantat-Chirurgie 1-2 Wochen nach der Virusinjektion, bereiten Sie sich auf die Prismensonde Implantat Chirurgie. Desinfektion der Prismensonde in 70% Ethanol und reinige sie mit Linsenpapier. Setzen Sie die Prismensonde in das Linsenhalterwerkzeug ein und ziehen Sie die Sechskantschraube mit dem Schraubendreher fest. Setzen Sie das Mikroskop in den Sockelhalter (dieMagneten halten es an Ort und Stelle). Bereiten Sie das Tier vor, wie im Abschnitt "Präoperative Vorbereitung" beschrieben. Trimmen und rasieren Sie den Kopf des Tieres zwischen den Augen und Ohren und desinfizieren Sie die Haut mit wechselnden Tupfern von 70% Ethanol und Betadin. Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie die Haut mit einer sterilen Schere schneiden und entfernen Sie die Hautklappe und das darunterliegende Periost. Den Schädel mit Wattestäbchen trocknen und polieren. Sorgen Sie für eine ausreichende Entfernung des umgebenden Muskelgewebes, um eine saubere, trockene, breite Knochenfundament in Vorbereitung für die folgenden Schritte zu schaffen. Implantatschädelschrauben in der kontralateralen Hemisphäre, um das Implantat stabil und sicher zu machen. Diese können auch nützlich sein, wenn man sich dafür entscheidet, eine Kopfstange für die wache Kopfbefestigung zu implantieren, um das Tier für experimentelle Bildgebungssitzungen in Abschnitt 5 vorzubereiten. Nähern Sie den Schädel und mit einem Marker markieren Sie die AP- und ML-Koordinaten für die Linseneinführung. Mit einem 0,5 mm Grat auf einem Mikrobohrer öffnen Sie eine runde Kraniotomie, so dass thE craniotomy Durchmesser ist gerade größer als der Prismen Durchmesser, dh 1,0 mm in diesem Fall. Bohren Sie sanft, während Sie intermittierend pausieren, um den Schädel mit sterilem PBS zu spülen und ihn mit Wattestäbchen abzusaugen. Entfernen Sie den erzeugten Knochenstaub. Kritischer Schritt: Legen Sie die Kraniotomie so, dass, wenn das Prisma in die Kortikalis eingefügt wird, seine flache Kante (Abbildungsoberfläche) der Virusinjektionsstelle gegenüberliegt und sich innerhalb eines Radius von 150-200 μm befindet. Stoppen Sie die Bohrung, bevor der Schädel vollständig verdünnt ist. Blutgefäße sollten durch den verdünnten Knochen sichtbar sein. Den Knochenstecker vorsichtig mit feiner 45 ° Pinzette entfernen. Entfernen Sie die Dura mit # 5 Pinzette. Kritischer Schritt: Sobald das Hirngewebe ausgesetzt ist, halten Sie immer das Gewebe feucht. Legen Sie einen Wattestäbchen in sterile Kochsalzlösung über die Kraniotomie getaucht. Dies wird auch den Druck auf das Gewebe beibehalten. Um den Druck im Gehirngewebe zu lindernRing-Insertion der Prismensonde, schaffen einen Inserttrakt vor der Zeit. Befestigen Sie ein geradkantiges Sektionsmesser an dem Elektrodenhalterarm des Stereotaxapparates und montieren Sie es auf dem Stereotaxikapparat unter einem Winkel, so dass die Messerklinge senkrecht zur Krümmung des Schädels ist (in diesem Fall 10 °) und in einem Ebene parallel zur Virusinjektionssäule. Sorgfältig das Messer oberhalb der Kraniotomie entlang seiner vorderen medialen Kante in diesem Fall und ~ 200 μm lateral zur Virusinjektionsstelle mit der Schneide nach vorne zeigen (Abbildung 1 ). Ziehen Sie die Z-Achse heraus, wenn die Messerspitze die Pia berührt und sie allmählich (in 10 μm / s-Schritten) bis zu einer Tiefe senken, bei der die Prismensonde eingelegt wird. Dann das Messer 1 mm nach hinten bewegen, um einen Weg für die Vorderkante des Prismas zu schaffen. Pause und Kontrolle für jede Blutungen, die auftreten können, während die Inzision mit einem vor-sterilen Kochsalzlösung getränkten Stück Gelfoam. <li> Sobald das Messer in dieser Position ist, spülen Sie die Website mit steriler Kochsalzlösung und warten Sie, bis irgendeine Blutung nachlässt. Dann langsam das Messer mit dem stereotaxischen Arm Mikromanipulator in 10 μm / s Schritten zurückziehen und legen Sie ein Stück Gelfoam Schwamm in sterile Kochsalzlösung über den Einschnitt getränkt. Befestigen Sie den Objektivhalter (mit Prisma-Sonde und Mikroskop) an den stereotaktischen Manipulatorarm im gleichen Winkel wie das Messer im vorherigen Schritt. Richten Sie das Prisma so aus, dass die flache Seite des Prismas über dem Einschnitt und parallel zur Virusinjektionskolonne liegt. Dieser Schritt könnte eine feine Korrektur der stereotaxischen Armposition erfordern. Passen Sie die Ausrichtung an, indem Sie dem Schädel nahe kommen, um schnellere Ergebnisse zu erzielen. Sobald das Prisma im richtigen Winkel ist, senken Sie es im Gehirn in 10-μm-Schritten allmählich auf ein endgültiges z von 1,1 mm für diese Sonde, ausgehend von der Hirnoberfläche. Das Hirngewebe wird sich um das Prisma erweitern und jeder Druck, der geschaffen wird, ist hinter dem VisualizatiAuf dem Flugzeug und wird das Sichtfeld nicht beeinträchtigen. Stecken Sie das Mikroskop auf einen Computer mit über einen USB3-Port installierten Akquisitionssoftware und visualisieren Sie die Feldfluoreszenz, indem Sie die LED einschalten. Decken Sie jedes exponierte Gewebe um das Prisma in der Kraniotomie in einer sehr dünnen Schutzschicht aus Elastomer-Kleber mit einer 25G-Nadel. Nachdem der Elastomer-Klebstoff gehärtet ist (üblicherweise in ~ 3-5 min), verwenden Sie eine 25G-Nadel, um einen Cyanoacrylat-Kleber aufzubringen, um das Glas der Prismenlinse an den angrenzenden Schädel über der Schicht aus Elastomer-Kleber zu befestigen, um zu verhindern, dass sich die Linse nach innen bewegt Die Kraniotomie. Fügen Sie die Kanten der Prismenfühler-Manschette für eine bessere Haftung ein. Auf der Oberseite der implantierten Prismensonde kein Klebstoff aufnehmen. Sobald der Cyanoacrylat-Kleber ausgehärtet ist, schrauben Sie den Linsenhalter ab und entfernen Sie das Mikroskop vorsichtig. Dann langsam den stereotaxischen Manipulatorarm zurückziehen, um die Prismensonde sicher implantiert zu lassen. Tragen Sie eine Schicht aus zahnärztlichem Acryl oderCyanoacrylat-Klebstoff um das Implantat, um alle exponierten Schädeloberflächen zu bedecken, bis hin zum Berühren des umgebenden zurückgezogenen Muskelgewebes. Die Abdeckung einer großen Schädelfläche mit dieser Schädelkappe wird später bei der Herstellung von Basisplatten helfen. Die Haut um die Implantat-Stelle sollte auf eigene Faust um die Schädelkappe heilen. Kritischer Schritt: Lassen Sie sich nicht von der umgebenden Haut oder dem Muskelgewebe berühren und verschütten Sie keine Haut in die Schädelkappe. Dadurch wird die Haut irritiert und kann zu übermäßigem Kratzer und potenziellen Schäden am Implantat führen. Optional: Wenn Sie ein waches Kopf-feste Setup verwenden möchten, um das Mikroskop an die Basisplatte eines Tieres in experimentellen Imaging-Sessions anzubringen und zu lösen, anstatt das Tier kurz zu betäuben oder zu schälen, implantieren Sie eine Kopfstange in die Schädelkappe, die mit einem wachen Kopf- Feste Einrichtung der Wahl (nicht in diesem Protokoll gezeigt). Mischen Sie den Katalysator und die Basis aus einem SiliziumE Klebspritze und legen Sie einen Tropfen des Elastomers in die Prisma-Sonde Manschette, um die Sonde Objektiv oben zu decken, um Schäden und Staub zu verhindern. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaxischen Rahmen und erlauben die Erholung von der Anästhesie in einer warmen Kammer. Verabreichen Sie Ketoprofen (2,5 mg / kg) oder Carprofen (2,5 mg / kg) subkutan und bringen Sie das Tier zu einem sauberen Hauskäfig zurück, sobald es ambulant ist. Ein einziges Haus alle Themen, um das Implantat zu schützen und wiederholen Sie die Dosis 24 Stunden später. 4. Grundplattenbefestigung für Miniaturmikroskop-Installation Eine Woche bis 10 Tage nach der Implantation der Prismensonde, auf Virus-Expression im Gewebe durch die implantierte Prismensonde prüfen und eine Basisplatte auf den Schädel aufbringen, wenn die Präparation die Zellaktivität zeigt. Das Mikroskop wird während der Live-Bildgebung auf der Basisplatte angedockt. Befolgen Sie die Schritte, die in der präoperativen Vorgehensweise für die Vorbereitung des Tieres für die Basisplattenbefestigung beschrieben sind. Entfernen Sie die Silikon-Klebstoff-Kappe über die Oberfläche der implantierten Prismensonde Objektiv oben. Untersuche die Linsensondenoberfläche und reinige alle Schmerzen vorsichtig mit Linsenpapier und 70% Ethanol, um sicherzustellen, dass die Abbildungsoberfläche sauber ist. Stecken Sie das Mikroskop in die DAQ-Box und verbinden Sie es über den USB3-Port mit dem PC. Öffnen Sie die Erfassungssoftware auf dem Computer und schließen Sie das Mikroskop über USB3-Port an. Verwenden Sie die Erfassungssoftware zur Überprüfung der neuronalen Aktivität und zum Messen und Dokumentieren der Sichtfeldeinstellungen für zukünftige Aufnahmen in diesem Fach. Befestigen Sie eine Basisplatte am Mikroskop und befestigen Sie die Basisplatten-Set-Schraube, um die Basisplatte in Position zu halten, und sichern Sie das Mikroskop in den Mikroskop-Greifer auf dem stereotaktischen Mikromanipulatorarm durch den Körper des Mikroskops. Bringen Sie den Greifer an einen Newportstab an, der auf dem stereotaxischen Mikromanipulatorarm montiert werden kann. Positionieren Sie das Mikroskop über dem Prisma-Objektiv mit den sTereotaxischer Mikromanipuatorarm Sichtprüfung der Orientierung durch Betrachtung des Prismenlins von der Seite und der Rückseite der Tierstufe. Die optischen Achsen sowohl des Mikroskopobjektivs als auch der Prismensonde müssen ausgerichtet sein. Schalten Sie die Mikroskop-LED durch die Software ein. Auswertung der Qualität der Mikroskopausrichtung durch Fokussierung auf die Oberseite des implantierten Prismenfühlerobjektivs in der Erfassungssoftware. Bei korrekter Ausrichtung sollten die Kanten der Oberseite des Prismenobjektivs scharf sein. Passen Sie den physikalischen Abstand des Mikroskops über die implantierte Prismensonde unter Verwendung des stereotaktischen Manipulatorarms an, um die gewünschte Brennebene innerhalb des Gewebes zu erhalten. Der optisch optimierte Abstand zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem implantierten GRIN-Objektiv beträgt ~ 500 μm. Speichern Sie ein Referenzfluoreszenzbild, sobald die gewünschte Bilderzeugungsebene erfasst ist. Kritischer Punkt: Von diesem Punkt an nicht die Position des Mikroskops einstellen, da dies die locati ändern wirdAuf der Abbildungsebene im Gewebe. HINWEIS: Klebstoff im nächsten Schritt auftragen, um die Position der Grundplatte dauerhaft in Bezug auf die Schädelkappe zu fixieren. Der Klebstoff kann im nächsten Tag oder zwei eine gewisse Volumenschrumpfung erfahren, die die Brennebene im Gewebe verändern kann. Preemptiv dies zu berücksichtigen, indem man die Schrumpfungsmenge für Ihre Klebemischung und den Abstand ex vivo misst und dann die endgültige Z-Position des Mikroskops + Basisplatte um diesen Betrag stützt, bevor sie in den Klebstoffauftragschritt übergeht. Verwenden Sie zahnärztliches Acryl oder Cyanoacrylat, um die Basisplatte dauerhaft an der Acrylkappe zu befestigen, die den Schädel des Tieres bedeckt und die Lücke mit dem Acryl oder dem Klebstoff überbrückt. Wenn man das Dentalacryl / Cyanoacrylat allmählich einsetzt und in mehreren Stufen härtet, kann der Effekt der zuvor erwähnten Schrumpfung auf die Endposition der Bildebene des Mikroskops minimiert werden. Kritischer Schritt: Vorsicht beim Auftragen von ZahnmedizinAcryl / Cyanoacrylat, um zu verhindern, dass jedes Material die Objektivlinse des Mikroskops, die Stellschraube oder den Mikroskopkörper berührt, wodurch ein ordnungsgemäßer Betrieb der Instrumentierung später verhindert wird. Kritischer Schritt: Beim Auftragen des Klebers nicht auf das Mikroskop drücken. Der Druck auf das Mikroskop oder die Basisplatte kann eine Bewegung des Mikroskopobjektivs relativ zu der Prismensondenlinse verursachen, was zu einer Fehlausrichtung oder einer Veränderung der Brennebene im Gewebe führen könnte, die eine sofortige Wiedereinstellung erfordert. Vergewissern Sie sich, dass das Dental-Acryl / Cyanoacrylat gehärtet und gehärtet ist, indem Sie das Acryl mit einer Pinzette oder Spritzenspitze antippen. Erwerben Sie ein endgültiges Referenzfluoreszenzbild mit der Erfassungssoftware. Das Mikroskop vom Greifer lösen und den Greifer vom Mikroskop zurückziehen. Wenn Cyanoacrylat oder ein anderer transparenter Klebstoff verwendet wurde, bedecken Sie ihn mit schwarzem Nagellack oder einer Schicht aus schwarzem Zahnzement, um ein zu verhindernLeckere Leckage in die Kopfhaube, die zukünftige Bilder, die während der Experimente gewonnen wurden, verunreinigen kann. An diesem Punkt entfernen Sie das Mikroskop bei Bedarf. Um das Mikroskop von der Grundplatte zu trennen, lösen Sie die Schraube der Grundplatte, indem Sie die Stellschraube ca. 1/2 Umdrehung gegen den Uhrzeigersinn drehen. Pressen Sie den Mikroskop-Körper, während Sie die Grundplatte und die Acrylkappe mit der anderen Hand stützen und das Mikroskop gerade nach oben ziehen. Ersetzen Sie es in seinem Vorratsbehälter. Schützen Sie die implantierte Prismensonde mit einer Grundplattenabdeckung. Dadurch wird verhindert, dass sich Staubpartikel auf der Linsenoberfläche absetzen, was nach dem Einbau der Basisplatte schwierig zu reinigen ist. Befestigen Sie die Grundplattenabdeckung auf der Grundplatte und schieben Sie die Stellschraube um ca. 1/2 Umdrehung im Uhrzeigersinn oder bis die Stellschraube bündig mit der Grundplattenabdeckung ist. Nicht überdrehen. Das Tier aus der Anästhesie entfernen und in einer warmen Erholungskammer bis zum Ambulanten überwachen. Rückkehr thE Tier zu seinem Hauskäfig. Im ganzen Haus alle Tiere mit implantierten Grundplatten zum Schutz des Implantats. 5. Imaging mehrerer kortikaler Schichten in einer frei beweglichen Maus Vorbereiten des Verhaltensapparates ( zB Phenotyper, Noldus) durch Reinigung und Desinfektion und Abwischen mit 10% Bleichlösung. Stecken Sie das Mikroskop in die DAQ-Box und verbinden Sie es mit dem Computer und starten Sie die Erfassungssoftware. Überprüfen Sie auf ausreichend Speicherplatz auf dem Erfassungsrechner und stellen Sie Platz für die Kalzium-Imaging-Filme. Speichern Sie direkt von der Software auf die lokale Festplatte, anstatt auf eine externe Festplatte zu schreiben, um die hohe Datenübertragungsrate zwischen dem Mikroskop und dem Computer zu berücksichtigen und Datenverlust während der Aufnahmen zu vermeiden. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran (5% in Sauerstoff) in einer Induktionskammer, um das Mikroskop zu befestigen. Alternativ, sanft scruff das Tier oder verwenden Sie eine wach Kopf-feste SetupMit einer Kopfstange, wenn die Anästhesie bekannt ist, das Verhaltens-Paradigma der Wahl zu stören. Entfernen Sie die Abdeckung der Grundplatte, indem Sie die Grundplatte-Stellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen und die Grundplattenabdeckung herausheben. Setzen Sie das Mikroskop in die Grundplatte auf das Tier. Das Mikroskop sollte mit Hilfe der Magneten auf der Grundplatte einrasten. Vorschub die Grundplatte einstecken, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist. Kritischer Schritt: Ziehen Sie die Schraube der Grundplatte nicht fest an, um eine Beschädigung des Mikroskopgehäuses zu vermeiden. Überprüfen Sie die Abbildungsebene im Gewebe, indem Sie einen Fluoreszenz-Schnappschuss in der Software erwerben und ggf. die Brennebene in das Gewebe einstellen, indem Sie die Mikroskop-Revolver-Set-Schraube lösen, den Mikroskop-Revolver drehen, um den Feinfokus einzustellen und dann den Revolver wieder festzuziehen Gehäuse-Schraube Kritischer Schritt: Den Turm niemals zwingen, sich zu drehen, ohne zuerst die Stellschraube zu lösen, undZiehen Sie die Revolver-Schraube nicht mehr fest. Wenn Sie eine Längsschnittstudie durchführen, kehren Sie zur physischen Revolverposition zurück, um das gleiche Gesichtsfeld zu erfassen. In der Hardware beachten Sie die Anzahl der Revolverwindungen oder die physische Position des Revolverkopfes, für jedes Tier, das mit demselben Mikroskop abgebildet ist, für eine schnelle Rückkehr zu demselben Gesichtsfeld. Lassen Sie das Tier, das das Mikroskop trägt, in den Hauskäfig oder die Verhaltenskammer für die Akklimatisierung und warten Sie auf das Abnutzen der Anästhesie, falls zutreffend. Kritischer Schritt: Trainieren Sie die Tiere, um das Gewicht des Mikroskops mit einem Dummy-Mikroskop für mehrere Sitzungen zu tragen, bis sichergestellt ist, dass das Tragen des Mikroskops nicht mit ihrem normalen Verhalten stört, bevor Sie experimentelle Sitzungen beginnen. Regelmäßige Handhabung und Schulung für wache Zurückhaltung wird zu unangemessenen Stress für die Tiere zu verhindern. Wählen Sie die Erfassungseinstellungen aus, die zum Sammeln von Daten verwendet werden sollen. Dazu gehört die FraIch Rate für die Erfassung von Daten ( zB 20 fps, Gain of 1 und LED Power von 50%). Überprüfen Sie das Bildhistogramm bei der Auswahl der Einstellungen, um ein gutes SNR zu gewährleisten. HINWEIS: Die numerische Apertur für die Fluoreszenzsammlung beträgt 0,35 für die 1 mm Prismensonde im Vergleich zu 0,5 für die 1 mm gerade Sonde. Starten Sie die Verhaltenssoftware und programmieren Sie sie, um das Mikroskop bei dem gewünschten Aufzeichnungszyklus auszulösen ( zB 4X 5 min EIN 2 min AUS). Verbinden Sie den TTL-Port auf der Noldus IO-Box mit dem TRIG-Port der DAQ-Box über ein RJ45-BNC-Kabel. Setzen Sie das Tier in die Verhaltensarena, wenn nicht bereits dort, und starten Sie das Experiment. Nach dem Erwerb der gewünschten Daten das Tier mit Isofluran (5% in Sauerstoff) in einer Induktionskammer wieder anästhesieren oder das Tier vorsichtig wachhalten. Lösen Sie die Schraube der Grundplatte und lösen Sie das Mikroskop von der Grundplatte, indem Sie das Mikroskop vorsichtig hochziehen. Setzen Sie die Grundplatte wieder auf und ziehen Sie die Grundplatte vorsichtig anTe Schraube Bringe das Tier bis zur nächsten Aufnahmesession zum Hauskäfig zurück. Verwenden Sie die Referenz-Fluoreszenzbilder als Leitfaden für nachfolgende Bildsitzungen, um in das gleiche Sichtfeld zurückzukehren. 6. Auswertung von großformatigen Ca 2+ -Bildgebungsdaten Um den Zellstandort und die Ca 2+ -Dynamik im Sichtfeld aus Daten zu extrahieren, können unterschiedliche Datenanalyseplattformen verwendet werden. Mosaic, eine Datenanalyse-Plattform, die speziell für die Verarbeitung von großformatigen Ca 2+ Imaging-Filmen entwickelt wurde, wurde hier für diese Studie verwendet. Beseitigen Sie defekte Pixel und interpolieren Sie alle einzelnen gelöschten Frames in den Rohfilmen im Vorverarbeitungsschritt. Bin die Bilder im Raum aus dem vollen 1.440 x 1.080 Pixel Sichtfeld auf 720 x 540 Pixel, um den Datenabdruck zu reduzieren. Um Bewegungsartefakte im Gehirn in Bezug auf den Mikroskop-Bildsensor zu korrigieren, registrieren Sie die Filme mit einem rigorosen ImageJ-basierten BildGistrationsalgorithmus (TurboReg). Um einzelne Neuronen zu identifizieren, wiederholen Sie die Bilder als relative Änderungen der Fluoreszenz ΔF / F 0 = FF 0 / F 0, wobei F 0 das mittlere Bild ist, das durch Mittelung des gesamten Films erhalten wird. Identifizieren Sie die räumlichen Filter, die einzelnen Zellen entsprechen, mit einem etablierten Zellsortieralgorithmus. Hier haben wir die Haupt- und Einzelkomponentenanalyse 21 zur Identifizierung einzelner Neuronen verwendet. HINWEIS: Ein Ereignis wurde angegeben, wenn die Spitzenamplitude eines Ereignisses in einer Trace mehr als 8 Standardabweichungen von der Trace-Baseline in unserem Datensatz und dem Zellstandort war und Ca 2+ -Dynamikdaten zur weiteren Analyse exportiert wurden.