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의학

Automotive Radiochemical Synthesis of [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: Um novo marcador de PET para imagens de doenças desmielinizantes

Published: May 29, 2017
doi:
10.3791/55537
, , ,
1Department of Neurology,The University of Chicago, 2Department of Radiology,The University of Chicago

Summary

Demonstramos a síntese radioquímica semi-automatizada de [18F] 3F4AP e procedimentos de controle de qualidade.

Abstract

3- [18F] fluoro-4-aminopiridina, [18F] 3F4AP, é um análogo radiofluorinado do fármaco aprovado pela FDA para a esclerose múltipla 4-aminopiridina (4AP). Este composto está actualmente a ser investigado como um marcador de PET para desmielinização. Recentemente descrevemos uma nova reação química para produzir piridinas metafluorinadas consistindo em fluoração direta de um N-óxido de piridina e a utilização desta reação para a síntese radioquímica de [18F] 3F4AP. Neste artigo, demonstramos como produzir este traçador usando um sintetizador automatizado e um reator de hidrogenação de fluxo feito em casa. Mostramos também os procedimentos padrão de controle de qualidade realizados antes de liberar o radiotracer para estudos pré-clínicos de imagem animal. Este procedimento semi-automatizado pode servir como base para a futura produção de [18F] 3F4AP para estudos clínicos.

Introduction

A capacidade de rastrear um fármaco de pequena molécula de forma não-invasiva dentro do corpo humano tem grande potencial para a medicina de precisão. Entre as técnicas de imagem molecular, a tomografia por emissão de positrões (PET) tem muitas características favoráveis: a alta sensibilidade dos detectores de PET permite a detecção e quantificação de quantidades muito pequenas de material radioativo e as características dos scanners permitem um mapeamento espacial preciso da localização do fármaco 1 , , 3 . Por exemplo, PET permite a detecção e localização de tumores e metástases com base no nível de captação de um análogo de glicose radioactivo, [ 18 F] FDG 4 . PET também pode fornecer localização e quantificação de receptores específicos do cérebro e sua ocupação que pode ser valioso para o diagnóstico e compreensão neurológica e transtornos psiquiátricos 5 . Para desenvolverUm marcador de PET de pequena molécula, o composto de interesse deve ser marcado com um isótopo emissor de positrão, tipicamente 11 C ou 18 F. Entre estes dois radioisótopos, 18 F tem uma meia-vida mais longa (109 min vs. 20,3 para 11 C) , Que permite multi-dose e produção fora do local. No entanto, a adição de 18F a uma molécula pode ser desafiadora. 18 F requer reações rápidas compatíveis com automação, aliviando o químico de manipulação direta da atividade e recebendo doses de radiação de alta absorção.

Recentemente descrevemos a utilização de N-óxidos de piridina como precursores para a fluoração de piridinas e a utilização desta química na síntese radioquímica de [18F] 3F4AP6, um análogo radiofluorado do fármaco aprovado pela FDA para esclerose múltipla, Aminopiridina (4AP) 7 , 8 , 9 . ºÉ novo radiotracer está atualmente sob investigação como um marcador PET para desmielinização 10 , 11 , 12 . Neste artigo de vídeo, demonstramos a síntese semi-automatizada deste composto utilizando uma Unidade de Síntese IBA Synthera (doravante referido como "o sintetizador") e um dispositivo de hidrogenação de fluxo feito em casa. A síntese é baseada na reacção ilustrada na Figura 1 . A preparação para o procedimento demora cerca de 1 h, radiomarcação e purificação 1,5 h e procedimentos de controlo de qualidade 0,5 h.

Protocol

CUIDADO: Todos os procedimentos envolvendo o uso de materiais radioativos devem ser aprovados pelo Escritório de Segurança de Radiação local. Ao trabalhar com materiais radioativos, use um casaco de laboratório e crachás pessoais de radiação. Use duas camadas de luvas em todos os momentos e verifique as mãos com um contador Geiger após cada etapa que envolve manipulação radioatividade. Se as luvas estiverem contaminadas com radioactividade, elimine as luvas e substitua-as. Use blindagem apropriada, minimize o tempo em contato com a fonte de radiação e maximize a distância. 1. Uma semana antes da experiência: Preparação de materiais Seqüência de download [18F] 3F4AP: os usuários do Synthera podem fazer login no banco de dados de usuários (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) e baixar o arquivo de seqüência para o 3F4AP. Os usuários de outros sintetizadores podem precisar escrever seu próprio script com base na seqüência de etapas. Navegue pela seqüência anotada para se familiarizar com asEnvolvidos na síntese. Certifique-se de que haja gás suficiente para a síntese. O sintetizador requer gás comprimido, hélio ou nitrogênio. Também requer> 75 psi de ar comprimido. Certifique-se de que as pressões estão dentro do recomendado pelo fabricante. Preparar a fase móvel de HPLC: preparar 1 L de fosfato de sódio 50 mM e trietilamina 10 mM. Utilizando um medidor de pH, ajustar o pH a 8,0 ± 0,1 por adição gota a gota de hidróxido de sódio saturado com agitação. Filtrar a solução através de um filtro de garrafa de 0,22 μm e adicionar 5% de volume de etanol. Vidros secos no forno durante a noite. 2. Dia da Experiência: Antes da chegada do Fluor-18 Utilizando seringas de 1 mL, encher os frascos dos reagentes com os reagentes apropriados. Para os frascos 2 e 3, utilize frascos secos e solventes anidros mantidos sob árgon. Selar os frascos com selos de friso usando um crimper. Encha o frasco 1 (11 mm de diâmetro / 2 ml de volume viAl) com 400 μL de TBA-HCO 3 + 800 μl de acetonitrilo (MeCN). Enche o frasco 2 (frasco de 13 mm / 4 mL) com 50 μL de solução precursora 1,0 mg / mL + 450 μL de MeCN. Encha o frasco 3 (frasco de 11 mm / 2 mL) com 500 μL de MeCN. Encher o Frasco 4 (frasco de 13 mm / 4 mL) com 4 mL de ácido oxálico a 0,2% em metanol (MeOH). Condição QMA (troca de anião forte) e Alumina-N cartuchos de extração em fase sólida. Utilizando uma seringa de 10 mL, passe 5 mL de NaHCO3 a 8,4% gota a gota através da QMA seguido de 5 mL de água desionizada Tipo I (18,2 ΜΩ • cm a 25 ºC). Passe 5 mL de água ultrapura gota a gota através do cartucho de Alumina-N seguido por 5 mL de MeOH + ácido oxálico a 0,2%. Ligar a HPLC e condicionar a coluna C-18 com 4 mL por min de fase móvel durante 30 min. Coloque um novo cartucho de catalisador no suporte do cartucho do hidrogenador e inicie um fluxo de 0,5 mL / min de MeOH a 100%. SE o regulador de hidrogénio a 50 psi e acondicionar o cartucho durante 15 min ( Figura 2 ). Montar o Processador de Fluidos Integrado (IFP) introduzindo os frascos 1 a 4 nas suas posições, colocando os cartuchos eo frasco de recolha como mostrado na Figura 3 . Anexar um frasco de coleta com uma agulha de ventilação para a linha de saída do hidrogenador. Inicie o software do sintetizador. Digite o login e a senha. Execute verificações prévias no sintetizador de acordo com as instruções do fabricante. Clique em "Seqüências" e depois em "Abrir" para carregar a seqüência 3F4AP. Carregue o IFP clicando no botão "Carregar" na tela. Digite um nome de arquivo para a execução e iniciar a seqüência clicando em "Iniciar". (O sintetizador automatizado pausará automaticamente antes do passo de carregamento de 18 F.) Veja como o sintetizador passa pelos passos de auto-verificação de rotina (parte uma da seqüência). Olhe para o screeN para garantir que não haja avisos ou alarmes. Preste atenção aos sons enquanto o sintetizador limpa as linhas e pré-aquece o recipiente de reação em preparação para a corrida. O indicador de temperatura deve subir e permanecer a 65 ºC. Aguarde o sinal (bip auditivo) indicando que o sintetizador está pronto para a transferência de 18F. 3. Dia do Experimento: 18 F Rotulagem Transferir remotamente a quantidade desejada de 18F produzido por ciclotrão do alvo de ciclotrão para o frasco de 18F. Verifique a quantidade de radioatividade e registre-a com o tempo de entrega. NOTA: Se não utilizar uma linha directa para a transferência de 18 F , utilize uma seringa pré-cheia com uma agulha presa para transferir a actividade para o frasco através do septo. A quantidade de radioactividade de partida depende dos limites estabelecidos pelo Office of Radiation Safety e da quantidade desejada de traçador final. A quantidade típica varia entre 50 e 500 mCi. <lI> Retomar a sequência no sintetizador premindo "Retomar". Isto irá iniciar a transferência do 18 F para a QMA. Monitorar a progressão da síntese em toda a seqüência automatizada na tela do computador. Assista a transferência do 18 F do frasco para o QMA por 90 s. Após o aprisionamento de 18 F – em QMA, elui – se com solução de TBA – HCO 3 (frasco 1). (Parte dois da seqüência) Monitore os traços de pressão e temperatura no sintetizador enquanto o TBA 18 F é seco sob pressão reduzida (5 kPa) e aquecido (100 ºC), seguido de passos adicionais de secagem e arrefecimento. (Parte 3 da sequência) Observe a transferência de MeCN anidro (frasco 3) e solução precursora (frasco 2) para o reator e como ele reage durante 1 min à temperatura ambiente. A solução deve ser incolor ou muito fraco amarelo. (Parte 4 da sequência) Preste atenção à transferência de ácido oxálico(Frasco 4) no reactor. Observe como a solução é transferida de pressão do reator através do cartucho de alumina-N para o frasco do produto final. (Parte 5 da sequência) No final da seqüência, imprima o relatório, ejete o IFP, desligue os tanques de gás e feche o software. Ao primeiro estabelecer o procedimento, medir a radioactividade no cartucho de alumina-N e no frasco de recolha introduzindo separadamente o cartucho eo frasco no calibrador de dose. Registre a atividade eo tempo de medição. Coloque o cartucho usado em um recipiente de resíduos com chumbo. Coloque o frasco de recolha num recipiente blindado para transporte para o passo seguinte. Utilizando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 2 "ligada, transfira manualmente aproximadamente 100 μL de amostra da solução do produto intermediário para um frasco padrão de HPLC para controlo de qualidade no processo Injecte 10 μL desta amostra na HPLC para avaliar a pureza e Identidade do intermeDia. NOTA: Condições de HPLC: XDB 5 μm, coluna C18 de 9,4 x 250 mm. Fluxo 4 mL / min. Fase móvel (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH a 5%). Isocrático 15 min. 4. Dia da Experiência: Hidrogenação CUIDADO: A injeção do produto no hidrogenador deve ser feita usando as devidas precauções de blindagem. O gás de hidrogénio deve ser manuseado e ventilado adequadamente. NOTA: o reactor de hidrogenação pode ser ligado no lugar da coluna de HPLC no sintetizador e controlado utilizando o software do sintetizador. Ajustar o fluxo do hidrogenador a 0,5 mL / min iniciando a sequência de HPLC do sintetizador. Ajustar manualmente a pressão do hidrogênio a 50 psi. Depois de terminar as etapas de marcação e de extinção o sintetizador transferirá a solução do produto intermediário para o circuito hidrogenador / HPLC. Quando o pico radioativo aparece no HPLC software alternar a válvula de coleta para coletar o produto. Medir a radioactividade do produto bruto utilizando um calibrador de dose. NOTA: O produto bruto deve ser injectado num sistema automatizado de HPLC dentro de uma célula quente. Após a purificação, o produto final é então recolhido e distribuído numa pilha quente de fluxo laminar de ar ISO classe 5 asséptica de acordo com os regulamentos da USP e da FDA. 5. Dia da Experiência: Purificação e Preparação da Dose Injectar o produto em bruto na HPLC e utilizar o colector de fracções automatizado para recolher as fracções correspondentes ao pico do produto final. Cada tubo contém 0,66 mL de solução. NOTA: Condições de HPLC: XDB 5 μm, coluna C18 de 9,4 x 250 mm. Fluxo 4 mL / min. Fase móvel (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH a 5%). Isocrático 15 min. Recolher 4-15 min. Medir a radioactividade de cada fracção utilizando um calibrador de dose e registá-la. Combinar as frações com maior quantidadeS de radioactividade (tipicamente os tubos 14-18). Desenhe a solução do produto com uma seringa de 10 ml e passe a amostra através de um filtro de 0,22 μm num frasco estéril. Registre a quantidade de radioatividade, o final do tempo de síntese eo volume da solução no rótulo do frasco. Esta é a dose final para injecção. Colocar de lado ~ 0,8 mL da solução para testes de controle de qualidade. 6. Dia da Experiência: Testes de Controle de Qualidade (QC) Antes da libertação da dose: Inspecione a dose através de vidro protegido por chumbo. A solução deve ser transparente, incolor e isenta de partículas. Identidade radioquímica: Para RadioTLC: mancha uma gota da amostra em uma placa de TLC lado a lado com o padrão de referência. Executar a placa de TLC numa câmara de TLC utilizando 95% de MeOH: ácido acético a 5%. Visualize o padrão de referência sob iluminação UV e marque sua posição com lápis. Tape a placa de TLC para o estágio do scann radioTLCTempo de gravação do pico. Os valores de Rf do padrão de referência e do pico radioativo devem corresponder a 5%. Para RadioHPLC: executar 10 μL da dose com e sem o padrão de referência na HPLC. O tempo de retenção do padrão de referência eo pico radioativo devem coincidir. Um único pico de coeluição deve ser visto na amostra picada. Para a pureza radioquímica: medir a área sob curva para os picos alvo radioHPLC e radioTLC. A área do pico alvo deve ser> 95% da área para todos os picos radioativos combinados. Para a radioactividade específica: calcular a radioactividade específica como a quantidade de radioactividade no pico (medida no passo 5.2) sobre a quantidade de massa determinada a partir da área sob a curva do traçado UV HPLC utilizando uma curva de calibração pré-estabelecida. A radioactividade específica deve ser superior a 50 mCi / μmol. Para a análise de solvente residual: medir a quantidade de solvente residualTs (MeCN, MeOH) na dose utilizando cromatografia gasosa. Os níveis de solventes devem ser <0,04% para o acetonitrilo e <3000 ppm para o metanol. A quantidade de EtOH deve ser inferior a 10% p / v. Para o teste de integridade do filtro estéril (ponto de bolha): ligar o filtro utilizado no passo 5.3 a uma alimentação de azoto equipada com um regulador de pressão e submergir a agulha em água. Abra gradualmente a válvula de gás enquanto observa o manómetro. O filtro deve suportar pressões de até 50 psi sem estourar como evidenciado pela falta de um fluxo de bolhas da agulha. Aumentar a pressão para além de 50 psi até que um fluxo de bolhas sai da agulha. Registre esta pressão, é a pressão de ruptura e deve ser> 50 psi. Para a meia-vida do radionuclídeo: medir a radioactividade do produto em dois pontos de tempo ≥ 10 min entre si num calibrador de dose. Calcular a meia-vida usando a equação abaixo. A meia-vida deve coincidir com a de 18 F para dentro de 5 minutos (109 ± 5 min): T ½ calculado = 0,693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) Onde t é o intervalo entre as medições e A 1 , A 2 a atividade medida em cada ponto de tempo. Para a identidade e pureza radionuclídicas: obter o espectro de raios-γ de uma amostra do produto utilizando um contador gama. O espectro deve exibir um único pico-foto a uma energia de 511 keV. Não deve haver outros picos de foto no espectro. Para a análise de endotoxina: medir os níveis de endotoxina utilizando um ensaio de quantificação de endotoxinas cromogénicas LAL. Os níveis de endotoxina devem ser <1,75 EU / mL para um produto diluído 1:10 com um volume final de 10 mL. Documente os resultados de cada teste QC. Solte a dose para estudos com animais apenas se todos os testes forem aprovados. Liberação pós-dose: Para o teste de esterilidade: adicionar uma amostra da dose tanto ao tioglicolato fluido como à tripticasaCaldo de soja Nenhum crescimento deve ser visto na mídia após 14 dias. 7. Dia da Experiência: Cálculos (Tabela 1) Para o rendimento radioquímico corrigido sem decaimento (ndc RCY): calcular o ndc RCY como a quantidade de radioactividade no produto final sobre a radioactividade de partida. Para a eficiência de radiomarcação: calcular o rendimento de rotulagem como a razão de radioactividade no frasco de colheita em relação à radioactividade no cartucho de alumina-N (não incorporado [ 18 F] F-) e no frasco de recolha. Para o rendimento de hidrogenação: calcular o rendimento de hidrogenação como a quantidade de radioactividade no pico desejado sobre a radioactividade injectada na HPLC. Para as perdas de filtragem: calcular a filtragem perde como a radioatividade restante no filtro e seringa sobre a radioatividade antes da filtragem.

Representative Results

A síntese radioquímica de [18F] 3F4AP compreende dois passos ( Figura 1 ). O primeiro passo é realizado de uma forma totalmente automatizada utilizando a unidade de síntese ( Figura 3 ). Este sistema baseado em cassete utiliza quatro frascos de reagente e um frasco de reator e tem válvulas controladas por computador que permitem transferência e mistura de reagentes, bem como aquecimento, pressurização e evacuação do reator. Além disso, suporta cartuchos padrão de extração em fase sólida para separação de reagentes. A interface do computador permite aos usuários escrever e modificar scripts para executar suas próprias sínteses. No caso de [18F] 3F4AP, o procedimento de síntese é composto por cinco partes básicas. Na primeira parte, o sintetizador executa etapas de auto-verificação, pré-aquece o reator e espera o sinal do operador de que o 18 F está pronto. Durante a segunda parte, o flúor [18F] é transferido paraM o frasco de 18F no cartucho de permuta aniónica e eluiu-se do cartucho para o reactor utilizando uma solução de bicarbonato de tetrabutilamónio. A terceira parte, o sintetizador seca azeotropicamente o flúor [18F] sob vácuo para torná-lo reativo em relação ao deslocamento nucleofílico. Na quarta parte, o precursor é automaticamente adicionado ao reactor onde reage com o 18 F – para gerar o composto marcado. Finalmente, a reacção é desactivada pela adição de ácido oxálico a 0,2% em metanol, o que evita a decomposição promovida pela base do produto e a solução final é transferida sob pressão para o frasco de recolha depois de passar através de um cartucho de alumina N que prende qualquer Fluoreto não reagido. Após o passo de marcação ser completado, uma pequena amostra pode ser tomada para controlo de qualidade. A execução de uma amostra na HPLC fornece confirmação de que a etapa de rotulagemDa pureza radioquímica ( Figura 4 ). Além disso, a partir do traçado UV na HPLC a quantidade de massa do produto pode ser calculada utilizando uma curva de calibração pré-estabelecida. Enquanto a HPLC de controlo de qualidade em processo está a decorrer, é realizado o segundo passo de reacção, redução dos grupos N-óxido e nitro. Para fazer isto, o produto marcado é injectado automati- camente num dispositivo de hidrogenação interno baseado no método publicado por Yoswathananont et ai. 13 ( Figura 2 ). Este dispositivo é constituído por uma bomba de HPLC e um tanque de hidrogénio comprimido ligado ao dispositivo de hidrogenação de fluxo através de linhas equipadas com válvulas de retenção para impedir o retrocesso. O produto é empurrado pela bomba de HPLC e misturado com hidrogénio num misturador em forma de T. Esta mistura é então passada através de um pequeno cartucho contendo catalisador Pd / C a 10% num suporte sólido. Depois de passar pela cataO produto reduzido é então recolhido em pequenas fracções. Após hidrogenação, o produto bruto é transportado e injectado manualmente na HPLC para purificação do produto final ( Figura 5 ). A fase móvel da HPLC foi seleccionada para ser compatível com a injecção animal. Os picos correspondentes ao produto são então recolhidos e esterilizados por filtração para se obter a dose final. Antes de libertar a dose para os estudos de imagem PET, são realizados testes de controlo de qualidade. Estes testes são realizados para garantir que o traçador é a entidade química que é suposto ser e que é seguro para a injeção. Alguns desses testes podem não ser necessários para injeção em animais, mas geralmente é recomendado seguir as diretrizes de uso humano. Isso garante a qualidade do produto, o que aumenta a confiança nos resultados eTransição para a fabricação do produto para injeção humana. A Tabela 1 contém os parâmetros de síntese típicos incluindo a quantidade inicial de radioactividade, a quantidade inicial de precursor, o rendimento para cada passo, a actividade específica, a filtragem perde, etc. Estes parâmetros são úteis para a resolução de falhas ocasionais e futura optimização do procedimento. Figura 1. Esquema de reacção. A síntese radioquímica consiste na marcação por troca de 19 F / 18F seguida de hidrogenação catalisada por paládio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" /> Figura 2. Sistema de hidrogenação. Esquema do dispositivo. Este dispositivo é baseado na publicação de Yoswathananont et al. (Ref. 13). Figura 3. Esquema do processador de fluidos integrado (IFP) e dos reagentes do sintetizador. O IFP contém quatro frascos de reagente, um cartucho QMA e um frasco de um reactor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Traçadores UV e radioHPLC para produto intermediário. 3-fluoro-4-nitropiridina tem uma absorção característica a 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. Figura 5. Traçadores UV e radioHPLC para o produto final. 3-fluoro-4-amino-piridina absorve a 254 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Conceito Média (n = 4) SD Comentários Actividade inicial de 18 F (mCi) 148,0 44,9 Início da síntese Quantidade de precursor (μg) 50 </tD> 98% De HPLC-1 QC Spec. Aja. Intermedi�io (mCi / �ol) 122,9 29,7 A partir da HPLC-1 utilizando curva de calibração Recuperação de hidrogenação (dc) 74% 9,0% Corrigido para decaimento Pureza radioquímica de HPLC (HPLC-2) 90,7% 2,9% Calculado a partir de HPLC-2 Eficiência de secagem > 98% Corrigido para decaimento Filtragem da recuperação 93,5% 1,7% Corrigido para decaimento Volume de dose (mL) 3,3 Colete as frações com maior radioatividade Spec. Aja. Produto final (mCi / μmol) 75,5 30,0 A partir da HPLC-3 utilizando curva de calibração Eficiência de síntese 8,5% 3,6% Correção de não-decaimento Tempo de síntese (min) 104 11,2 Tabela 1. Parâmetros de síntese radioquímica. Problemas comuns Razões e soluções possíveis O fluoreto de [18F] não é eluído eficientemente a partir do QMA · TBA-HCO 3 não foi preparado corretamente. Assegurar que a concentração é adequada. · Há vazamentos no frasco TBA-HCO 3 . Certifique-se de que o vedante de aperto está apertado eo septo não é perfurado antes de instalá-lo no IFP. · TBA-HCO 3 não está em boas condições. Peça um lote novo. Rendimento de rotulagem baixo · Há umidade na solução precursora. Precursor seco e solventes. · A temperatura é muito baixa. A solução de reação é amarela · O produto está em decomposição devido à base. Utilizar menos TBA-HCO 3 . HáOo muito precursor. Use menos precursor. · Há muito pouco solvente para a quantidade de 18 F – . Use mais solvente. Picos adicionais em radioHPLC · O grupo Nitro está sendo substituído: reduz a temperatura da reação ou encurta o tempo de reação. A reação de hidrogenação não funciona · Catalisador não é bom. Use um novo cartucho. · O fluxo é muito rápido e não permite contato suficiente entre o catalisador eo substrato. Diminuir o fluxo. · A pressão do hidrogénio é demasiado baixa. Aumente a pressão de H2. A pressão do hidrogênio aumenta dramaticamente durante o procedimento · A integridade do cartucho está comprometida eo suporte sólido está obstruindo as linhas. Pare o fluxo e desligue o gás. Deixe a radioactividade cair. Remova o cartucho de catalisador e lave o sistema. Coloque umEw cartucho. O rendimento de hidrogenação é baixo · Demasiadas impurezas que competem pelo catalisador (MeCN, ácido oxálico). Diminuir a quantidade de impurezas ou aumentar a massa do precursor (Atenção: o aumento da quantidade de precursor reduzirá a atividade específica). A recuperação da radioactividade do passo de hidrogenação é baixa · Há um vazamento no sistema. Verifique se há vazamentos e refluxo na linha de hidrogênio. · O composto está defluorando no reator. Avaliar diferentes condições de reação (pressão, temperatura, fluxo, etc. ). Demasiada radioactividade é perdida durante a filtração · Molhe o filtro antes de usar. · Use filtro com um volume morto inferior. O pico do produto final na HPLC parece largo · Muito volume injetado. Inject lower amOunt. Use coluna com maior diâmetro. · A coluna não está bem condicionada. Condição da coluna para pelo menos 30 volumes de coluna. · O pH da fase móvel é baixo. Certifique-se de que o pH ≥ 8. · A coluna não está em boas condições. Substituir coluna. Use coluna compatível com pH básico. Tabela 2. Guia de solução de problemas.

Discussion

A preparação de marcadores PET requer rotulagem eficiente com mínima intervenção do usuário para minimizar a exposição à radiação 14 . Aqui, descrevemos o primeiro procedimento semi-automatizado para a síntese radioquímica de [18F] 3F4AP, um marcador PET atualmente sob investigação para a desmielinização por imagem. Este método semi-automatizado produz o radiotracer com alta pureza e atividade específica suficiente para estudos em animais. Os métodos anteriores para a síntese deste composto baseavam-se na síntese manual 6 , o que limita significativamente a quantidade de marcador radioactivo que pode ser produzido. Possuir um método automatizado para a síntese também proporciona rendimentos mais reprodutíveis e facilita a transferência do procedimento para outros laboratórios com equipamento semelhante. Futuros esforços para automatizar completamente o procedimento serão fundamentais para a produção do marcador em quantidades elevadas para estudos em grandes animais ou seres humanos.

<p cEste procedimento utiliza a troca nucleofílica de 19F para 18F para incorporar o radioisótopo na molécula de interesse. As vantagens desta reacção são que é rápida e produz quase exclusivamente o produto desejado sem a necessidade de realizar um passo de purificação potencialmente prolongado para remover o excesso de precursor. Uma limitação do uso de reacções de marcação por permuta de flúor, tal como a aqui utilizada, é que, devido à massa inicial do composto frio, a actividade específica final definida como quantidade de radioactividade em mCi em relação à quantidade de composto em μmol pode ser limitada. Nas nossas condições padrão, começando com 100-200 mCi de 18 F e 50 μg de precursor, a atividade específica típica no final da síntese é de até 100-200 mCi / μmol, o que parece ser suficiente para estudos pré-clínicos de PET . No entanto, a actividade específica pode melhorar, aumentando a quantidade inicial para 18 F – </suP> mantendo a quantidade de massa baixa. Houve vários relatos de produção de radioligandos por troca de flúor com alta atividade específica (1-3 Ci / μmol) iniciando com alta atividade e baixas quantidades precursoras 15,16 .

Tal como acontece com todas as sínteses radioquímicas dos marcadores PET, é crítico trabalhar rapidamente para minimizar a decomposição radioactiva. Também é importante minimizar o tempo de manuseio dos materiais radioativos, usar blindagem adequada e maximizar a distância entre o material radioativo eo usuário para minimizar a exposição à radiação. Estes aspectos são particularmente importantes durante a segunda metade do protocolo (purificação e controlo de qualidade) em que o utilizador tem de injectar manualmente a solução na HPLC, recolher as fracções e filtrar o produto final.

Como com todas as sínteses radioquímicas dos marcadores de PET, é crítico trabalharInimizam o decaimento radioativo. Também é importante minimizar o tempo de manuseio dos materiais radioativos, usar blindagem adequada e maximizar a distância entre o material radioativo eo usuário para minimizar a exposição à radiação. Estes aspectos são particularmente importantes durante a segunda metade do protocolo (hidrogenação e purificação) em que o utilizador tem de injectar manualmente a solução no hidrogenador, recolher as fracções, configurar o processo de secagem, redissolver o produto em tampão e filtrar. Durante o passo de filtragem é fácil perder uma grande quantidade de material radioactivo nas paredes dos frascos. Assim, é importante tentar recolher todo o líquido antes da filtragem. Utilizar uma quantidade maior de tampão para dissolver pode melhorar o rendimento de recuperação, mas a sua utilização é desencorajada porque requererá a injecção de um volume maior na HPLC, fazendo com que o pico se alargue e aumente o volume da dose final.

Para solucionar um problemaE otimizar o procedimento é importante para acompanhar os rendimentos de cada etapa. Para a maioria dos passos, isto é feito simplesmente medindo a quantidade de radioactividade antes e depois de qualquer passo. No caso da reacção, os rendimentos podem ser calculados através da quantificação dos picos de HPLC. A Tabela 1 na Seção de Resultados mostra os rendimentos típicos para cada etapa. A Tabela 2 abaixo lista muitas das falhas comumente encontradas com possíveis razões para a falha e como corrigi-las.

Finalmente, embora o procedimento aqui demonstrado seja específico para a síntese de [18F] 3F4AP, o fluxo de trabalho geral e muitas das etapas individuais são comuns à síntese de outros compostos 17 . Neste artigo também demonstramos os testes QC típicos realizados em qualquer marcador PET.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto foi apoiado pelo NIH / NIBIB 1K99EB020075 a Pedro Brugarolas e um Innovation Fund Award do Chicago Innovation Exchange para Brian Popko e Pedro Brugarolas. O Prof. Brian Popko é reconhecido com gratidão por sua orientação e apoio financeiro ao projeto. O Professor Chin-Tu Chen e o Recurso Integrado de Pesquisa em Imagens de Pequenos Animais da Universidade de Chicago são reconhecidos por terem generosamente compartilhado espaço e equipamentos de laboratório. A IBA é reconhecida por patrocinar o acesso aberto deste artigo.

Materials

Cyclotron produced [18F]fluoride House supplied/Zevacor IBA Cyclone 18 100-200 mCi
Integrated fluid processor for production FLT/FDG ABX K-2715SYN Cassette used for nucleophilic substitution
Anhydrous acetonitrile Janssen 36431-0010 Transfer under nitrogen
Methanol Janssen 67-56-1
ultrapure water house supplied Millipore MilliQ system
TBA-HCO3 ABX 808.0000.6 abx.de
QMA Waters WAT023525 Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water
Sodium bicarbonate ABX K-28XX.03 Prefilled 5 mL syringes
Alumina-N Waters WAT020510 Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-)
3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide Synthonix 76954-0 Store in desicator. Precursor
3-fluoro-4-aminopyridine Sigma Aldrich 704490-1G Reference standard
Oxalic acid Sigma Aldrich 75688-50G
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific  S80191-1
Triethyl amine Fisher Scientific  04885-1
Ethanol Decon Labs DSP-MD.43 USP
Final product vial ABX K28XX.04
Millex Filter Syringe Millex SLGVR04NL
10% Pd/C cartridge Sigma Aldrich THS-01111-12EA
11 mm vials + crimp seals Fisher Scientific  03-250-618, 06-451-117, or equivalent
13 mm vials + crimp seals Fisher Scientific 06-718-992, 06-718-643, or equivalent
HPLC vials Fisher Scientific 03-391-16, 03-391-17, or equivalent
SEMIPREP C18 column Agilent 990967-202
V-vials Alltech
Syringes: 1, 3, 10 mL Fisher Scientific 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent
Compressed gases: N2, He, H2 Airgas UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent
TLC plates Sigma Aldrich Z193275, or equivalent
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Synthera automated synthesizer IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com Synthera, 250.001 Automatic synthesis unit
In-house hydrogenator See picture See text description
Hot cells Comecer For manipulating radioactive materials
RadioTLC scanner Eckert and Ziegler For handling sterile materials
HPLC Dionex Ultimate 3000
Dose calibrator Capintec CRC15 Or equivalent
Gamma counter Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 CRC 15, PET-CRC25, or equivalent For measuring radioactivity
Personal dosimeters Packard Cobra II For measuring gamma spectrum
Personal radiation badges and rings Atlantic Nuclear Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent
Rotavap + vacuum pump Landauer
Lead pigs + syringe shields Heidolph Or equivalent
Geiger counters Pinestar
Ludlum  Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent
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References

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[18F]3F4APPET TracerDemyelinating DiseasesAutomated Radiochemical SynthesisFluorine-18HydrogenationSolid Phase ExtractionHPLC

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Brugarolas, P., Bhuiyan, M., Kucharski, A., Freifelder, R. Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases. J. Vis. Exp. (123), e55537, doi:10.3791/55537 (2017).
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