Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per indagare la distribuzione host-tessuto, modalità di trasmissione, e l'effetto sulla forma fisica host di un densovirus all'interno di una specie di lepidotteri, il bollworm cotone. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare l'interazione tra altri virus per via orale-trasmissibili e loro ospiti dell'insetto.
Abstract
Molti nuovi virus sono stati scoperti in ospiti animali che utilizzano tecnologie di sequenziamento di prossima generazione. In precedenza, abbiamo riportato un virus mutualistica, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in una specie di lepidotteri, il bollworm cotone, Helicoverpa armigera (Hubner). Qui, descriviamo i protocolli che sono attualmente utilizzati per studiare l'effetto di HaDV2 sul suo ospite. In primo luogo, stabiliamo un cotone bollworm colonia senza HaDV2 da una singola coppia di riproduttori. Poi, abbiamo oralmente inoculare alcuni prole larvale neonato con HaDV2 contenenti liquido filtrato per la produzione di due colonie con lo stesso background genetico: una HaDV2 infettati, l'altro non infetti. Un protocollo per confrontare parametri della tabella vita (ad esempio, larvale, pupa e periodi adulti e fecondità) tra gli individui HaDV2-infetti e -uninfected è anche presentati, come i protocolli per determinare la distribuzione host-tessuto e l'efficienza della trasmissione di HaDV2. Questi protocolli woULD anche essere adatto per lo studio degli effetti di altri virus trasmesse oralmente sui loro ospiti dell'insetto, gli host lepidotteri in particolare.
Introduction
Negli ultimi decenni, lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento, come sequenziamento di prossima generazione (NGS) ha facilitato la scoperta di molti DNA e RNA virus nuovi, virus particolare non patogeni, ma anche nuovi ceppi di virus già noti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Nel organismo modello Drosophila melanogaster, più di 20 nuovi genomi virali parziali sono stati rilevati utilizzando tecniche metagenomic 13. Molte sequenze virali, e nuovi virus, sono stati identificati in altri insetti, come api, mosquitoes, psille agrumi asiatica, libellule e specie multiple lepidotteri 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.
In futuro, si può prevedere che più nuovi virus saranno scoperti negli insetti che utilizzano queste tecnologie avanzate; di conseguenza, la nostra comprensione dell'interazione virus-ospite può cambiare di conseguenza 6, 9. Ad esempio, le interazioni virus-ospite sono considerati essere più complicato di quanto si pensasse, perché molti virus nuovi si stanno definendo come partner mutualistiche, piuttosto che gli agenti patogeni rigorose 22. Ad esempio, il DplDNV densovirus mutualistico in Dysaphis plantaginea induce il Variante alato e aumenta la mobilità, favorendo la dispersione del paese ospitante, così come il virus 23. Inoltre, i virus mutualistici sono stati descritti per quanto riguarda la salute dei mammiferi, la siccità e la tolleranza al freddo delle piante, e l'impatto delle infezioni batteriche 24. Seneca valle virus-001 è mostrato per mediare la citotossicità selettiva verso le cellule tumorali con il cancro neuroendocrino caratteristiche 25. Infezioni da virus dell'epatite A sopprimere la replicazione del virus dell'epatite C e può portare a recupero da epatite C 26. Latenza herpesvirus conferisce protezione simbiotico da infezione batterica 27. La glicoproteina busta di umana endogena retrovirus HERV-W induce resistenza cellulare milza necrosi virus 28. Curvularia virus tolleranza termica (CThTV) da un endophyte fungina è coinvolto nell'interazione mutualistica tra questo funghi e un'erba di panico tropicaleref "> 29. Quindi, la conoscenza delle interazioni tra i virus più recenti trovati ed i loro ospiti dovrebbe generare nuove prospettive sulla loro biologia e gestione. Tuttavia, i nuovi virus, in particolare i virus segrete che mostrano segni evidenti tipici di infezione acuta, raramente hanno stato indagato, e abbiamo bisogno di un oleodotto e protocolli per studiare gli impatti dei nuovi virus trovati sui loro ospiti.
In precedenza, abbiamo riportato la prevalenza di una nuova monosense densovirus Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) nella bollworm cotone, Helicoverpa armigera, e ha presentato le prove di un rapporto mutualistico tra la HaDV2 e il verme del cotone 30, 31. In questo articolo, descriveremo il protocollo laboratorio per studiare in dettaglio l'interazione tra HaDV2 e il suo ospite cotone verme. Il protocollo presentato qui può anche essere molto rilevante per i ricercatori che esaminano il role di altri virus per via orale trasmissibili, soprattutto in lepidotteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, la maggior parte degli studi sulle interazioni insetto-virus sono concentrati sulla salute miele delle api 34, 35, 36, vettori di malattie umane 37, impianto di virus 38, e alcuni virus patogeni di insetti che hanno un grande potenziale come agenti di controllo biologico 39. Poca attenzione è stata prestata ai virus segrete negli inse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Nazionale di Ricerca di base chiave della Cina (n 2013CB127602) e il Fondo Scienza for Creative gruppi di ricerca del National Science Foundation della Cina (n ° 31.321.004).
Materials
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | Multiple suppliers available. |
| DNA extraction kit | TIANGEN | DP304-03 | Multiple suppliers available. |
| thermal cycler | Veriti; Applied Biosystems | 4375786 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGS025NB | |
| pEASY-T Cloning Vector | TransGen, Beijing, China | CT301-02 | |
| Tweezers | IDEAL-TEK | 2.SA | |
| Premix Ex Taq (Probe qPCR) | Takara | RR390A | |
| Probes | Invitrogen | Custom order | |
| Primers | Invitrogen | Custom order | |
| microspectrophotometry NanoDrop 2000c | Thermo scientific | not available | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| stereomicroscope SZX-16 | Olympus | not available | |
| sucrose | Multiple suppliers available. | ||
| vitamin complex | Multiple suppliers available. |
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