מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

רצף הגנום הוא כלי רב עוצמה לנתח את הבסיס הגנטי הבסיסי של תכונות המפעל חשוב. רוב מחקרי הגנום-רצף מתמקדים בתוכן הגנום הגרעיני, שכן רוב הגנים נמצאים בגרעין. עם זאת, גנומים אורגנואר, כולל המיטוכונדריה (על פני eukaryotes) ופלסטידים (בצמחים, הצורה המקצועית, הכלורופלסט, עובד בפוטוסינתזה) לתרום מידע גנטי משמעותי חיוני לפיתוח אורגניזמים, תגובת מתח, ואת הכושר הכללי ¹ . גנומים של Organellar כלולים בדרך כלל בחריצות דנ"א הכוללות רצף גנומי גרעיני, למרות ששיטות להפחתת מספר האורגנים לפני החילוץ של דנ"א מועסקים גם ² . מחקרים רבים השתמשו תוצאות רצף מתוך סך gDNA חילוץ להרכיב genelles organellar ^{3 , 4 , 5 ,}Xref "> 6 ^{, 7.} עם זאת, כאשר המטרה של המחקר היא להתמקד genomes organellar, באמצעות gDNA הכולל מגדילה את עלויות רצף כי רבים קורא" אבודים "רצפי DNA גרעיני, במיוחד צמחים עם גנומים גרעיניים גדולים יתר על כן, בשל שכפול והעברת רצפים organellar לתוך הגנום הגרעיני בין האברונים, פתרון המיקום הנכון מיפוי של רצף קורא לגנום הנכון הוא מאתגר ביואינפורמטית ^{2 , 8.} טיהור genomes organellar מן הגנום הגרעיני הוא אחד אסטרטגיות ביואינפורמטיקה נוספות ניתן להשתמש כדי להפריד קורא את המפה לאזורים של הומולוגיה בין המיטוכונדריה ו chloroplasts.

בעוד גנומים organellar ממין צמחים רבים כבר רצף, מעט ידוע על רוחב של מגוון גנום organellarזמין באוכלוסיות בר או בבריכות גידול מעובדות. גנומים Organellar ידועים גם להיות מולקולות דינמיות שעוברות סידור מבניים משמעותי עקב רקומבינציה בין רצפים חוזרים ⁹ . יתר על כן, עותקים מרובים של הגנום organellar כלולים בתוך כל אברון, ואת האברונים מרובים נמצאים בתוך כל תא. לא כל העותקים של גנומים אלה זהים, הידועה בשם הטרופלסמי. בניגוד לתמונה הקאנונית של "חוגי אב", יש כיום ראיות גוברות לתמונה מורכבת יותר של מבני גנום, כולל חוגים תת-גנומיים, כרומוזומים ליניאריים, קונקאמרים לינאריים ומבנים מסועפים ¹⁰ . ההרכבה של הגנום צמח organellar הוא מסובך עוד יותר על ידי גדלים גדולים יחסית שלהם חוזר משמעותי הפוך ישיר.

פרוטוקולים מסורתיים לבידוד organellar, טיהור דנ"א, ואת הגנום הבאים רצף דואר הם לעתים קרובות מסורבל ודורשים כמויות גדולות של קלט רקמות, עם כמה גרם כלפי מעלה של מאות גרם של רקמת עלה צעיר צורך כנקודת התחלה ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} . זה עושה רצף הגנום organellar נגיש כאשר הרקמה מוגבלת. במצבים מסוימים, כמויות זרע מוגבלות, כגון כאשר יש צורך רצף על בסיס דורי או בקווים סטריליים זכרים כי צריך להישמר דרך חציית. במצבים אלה, DNA יכול להיות מטוהרים ולאחר מכן חשוף הגברה של הגנום כולו. עם זאת, הגברה שלמה הגנום יכול להציג הטיה רציף רצף, אשר היא בעיה מסוימת בעת הערכת וריאציה מבנית, מבנים גנומיים, ורמות heteroplasmy22 ההתקדמות האחרונה בהכנה לספריה לטווחים קצרים לקריאה של טכנולוגיות יש להתגבר על חסמי כניסה נמוכים כדי למנוע הגברה של הגנום כולו. לדוגמה, ערכת הכנה של ספריית NXTERA XT של Illumina XT מאפשרת מעט כמו 1 ng של DNA שישמש כקלט ¹⁹ . עם זאת, ההכנות הספריות סטנדרטיים עבור יישומים רצף לקרוא ארוך, כגון PacBio או אוקספורד Nanopore טכנולוגיות רצף, עדיין דורשים כמות גבוהה יחסית של ה- DNA קלט, אשר יכול להוות אתגר עבור רצף הגנום organellar. לאחרונה, חדש שפותח על ידי המשתמש, ארוך לקרוא פרוטוקולי רצף פותחו כדי להפחית את כמויות קלט כדי לעזור להקל על רצף הגנום בדגימות שבו קבלת מיקרוגרם כמויות של DNA קשה ^{20 , 21} . עם זאת, קבלת משקל מולקולרי גבוה, שברים organellar טהור להאכיל את ההכנות הספרייה הזאת נותרה אתגר.

חיפשנו לאO להשוות לייעל DNA העשרה organelar ושיטות בידוד מתאים NGS ללא צורך הגברה של הגנום כולו. באופן ספציפי, המטרה שלנו היתה לקבוע את שיטות העבודה המומלצות להעשרת עבור DNA גבוהה מולקולרית משקל organellar מחומרים החל מוגבל, כגון תת המדגם של עלה. עבודה זו מציגה ניתוח השוואתי של שיטות להעשיר עבור DNA organellar: (1) פרוטוקול צנטריפוגה דיפרנציאלית מסורתית שונה לעומת (2) פרוטוקול חלוקה DNA מבוסס על השימוש של דנ"א זמין מסחרית CpG-methyl- מחייב תחום גישה הנפתח חלבון ²² הוחל על רקמת הצמח ²³ . אנו ממליצים על שיטות עבודה מומלצות לבידוד דנ"א אורגני מחיידק עלה חיטה, אשר ניתן להרחיב בקלות צמחים אחרים ורקמות סוגים.