のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ<em>インビトロ</em>細胞培養

注：代謝活性アッセイのための一般的なワークフローを図2に概説されています。このワークフローの各ステップは、その後、次の段落で詳述されています。試薬および装置の詳細な表は材料の表に示されています。 図2：代謝プローブアッセイのワークフロー。細胞を播種し、十分な密度まで増殖させます。 CYP誘導ステップは、アッセイ、酵素活性に応じて必要となる場合があります。プローブ基質及び阻害剤は、細胞培養物に添加されます。インキュベーション期間の後、培地を分析のために収集され、細胞をタンパク質定量のために溶解されます。媒体は、質量分析又はルミノメトリーによるプローブ基板の代謝産物の分析のために処理されます。広告/ 55502 / 55502fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 1.細胞培養 図3：肝細胞株の文化の光透過顕微鏡写真。このプロトコル5に記載の細胞株は、典型的には、培養物中の胆管と肝細胞との間の50％のスプリット（100X）で分化します。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 肝細胞株培養 注：市販の肝細胞株は、代謝的にコンピテントな細胞の例として使用しました。細胞株は、ウイルス感染によって引き起こされる肝がん由来した7。コンフルエントに、この細胞株は、（ 図3）cholangiocyte-及び肝細胞様細胞に分化し、さらに詳細がGuillouzo 7に見出すことができます。培地に2％DMS​​Oを含むことは、のCYPの種々のこの細胞株および発現の分化を支持しています。 液体窒素から細胞を用いた極低温バイアルを取り外し、輸送のためにドライアイスの上に置きます。 1~2分間37℃に予熱した水浴中にクリオバイアルに移し、層流フード内に配置する前に70％エタノールでバイアルの外側を滅菌します。 無菌条件下で作業しながら、注意深く過剰な圧力を解放し、37℃で予熱したウィリアムズE培地の9 mLで充填された10mLのチューブに極低温バイアルの内容物をピペッティングするための極低温バイアルを開きます。 室温で400×gで10分間溶液を遠心し、上清を捨て、そして5mLに細胞を再懸濁独自の融解媒体は、37℃で予備加温しグルタミン、またはグルタミンサプリメント（2mMの最終濃度）（ウィリアムズE +グルタミンサプリメント+融解サプリメント）を補充しました。 セルカウンタ500μLのアリコートまたは任意の他の適切な細胞計数技術を用いて生細胞を数えます。 0.6×10 6生細胞/ウェルの密度で解凍培地0.5mlの最終体積で24ウェルコラーゲンコートプレートに細胞を播種します。 5％/ 95％CO 2 /空気および相対湿度100％で37℃のインキュベーター中でプレート（単数または複数）を置きます。 24時間細胞を播種した後、予め温めておいたメンテナンス/代謝作動媒体の0.5mLの（ウィリアムズE +グルタミンサプリメント+代謝サプリメント（この培地は既にDMSOを含有する））を含む培地を交換してください。 2日ごとに培地を変更します。 数日後に培養中の細胞はサブコンフルエント小柱構造（ 図3）を形成します。最適な代謝活性は、典型的には、7日目と10との間に観察され、4日目に最低です。 図4：気液界面8で成長アルシアンブルー染色の気道細胞の断面図。 繊毛、粘液産生および基底細胞がはっきりと見えます。スケールバー= 250μmで。 差別気道上皮培養 注：プロトコルは、インサート8（ 図4）に空気-液体界面で成長させ、市販の完全に分化した一次気道上皮で示されています。組織培養は、粘膜毛様体の表現型と細胞極性8を保持します。細胞は、鼻や気管支起源であり得ます。ここでは、人間の鼻の細胞を使用しています。細胞を24と培養プレートフォーマットで提供されています気液界面に挿入します。輸送を容易にし、媒体流出を避けるためにインサートを培養培地と混合したアガロースマトリックス中に埋め込まれた基底部に同梱されています。 細胞の送達の際に、清浄な層流フード内に配置する前に70％エタノール溶液で24のインサートを含有するプレートを滅菌します。 予め温めておいた700μLに独自の培地を添加することによって、滅菌24ウェルプレートを準備します。 滅菌ピンセットを使用して穏やかにアガロースマトリックスからインサートを取り除くことにより、媒体を予め装填され、新しいプレートに細胞インサートを転送します。 5％/ 95％CO 2 /空気および相対湿度100％で37℃のインキュベーター中でプレート（単数または複数）を置きます。 2日ごとに、新しい滅菌24ウェルプレートを700μL暖かい独自の気道細胞培養培地にあらかじめロードされたに挿入を転送します。 そのような経上皮抵抗（TEER）のような方法を使用して、気道組織の完全性を評価、または繊毛は、ライブビデオ画像システム9を取り付けた顕微鏡を使用して周波数（CBF）を打ちます。 TEERおよびCBFの測定はキューン10に記載されています。 細胞培養で2 CYP活動定量注：一般的なルールとして、例えばDMSO、メタノールなどの溶媒が、この論文で提示異なる代謝プローブおよび阻害のためのストック溶液を調製するために使用することができます。しかしながら、高濃度の代謝酵素を阻害することができるので、最小値（1％以下）に培地中の最終DMSO濃度を維持することが推奨されます。可能な場合、プローブの可用性を低下させることができ、また、フェノールレッドは、アルブミンなどのCYP及びフェーズII酵素活性および血清成分を妨害することができるので、代謝プローブとのインキュベーション中に遊離フェノールレッドおよび無血清培地を使用することが推奨されます。厳密にこれらを遵守することは必ずしも可能ではありませんガイドライン。例えば、気道細胞培養培地は、独自であり、フェノールレッドを含ま。細胞が肝細胞様の表現型を採用することが必要とされる独自の肝細胞株代謝媒体7は、既に1％上方DMSOを含有します。 注：最後に、ここでは、用語特異的プローブ/阻害剤が使用されるが、この用語は慎重に考慮しなければなりませんさ。代謝プローブは、酵素基質排他的であるために、実際に、それは非常に稀です。ここで説明したプローブは、しかしながら、それらの酵素標的に対して高い親和性を有し、従って活性の信頼できるマーカーとしてみなされます。 代謝プローブ、誘導物質、および阻害剤 質量分析に基づく方法を用いてプローブ注：このセクションで説明するプローブおよび阻害剤はCYP2As 11の活性を試験するのに適している、CYP1A2 12、REF "> 13、CYP2B6 7、14、CYP2F1 15、16、及びCYP2E1 17 UPLC-質量分析による。プローブ、阻害剤およびCYP対応する、対応する参照して、表1に記載されている。 表1はまた、CYPの代謝産物を示しています質量分析法により定量される活性は、組織培養における使用のための組織培養およびソリューションを含むすべての作業は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。ストック溶液は、すべてのプローブ基板にDMSO中で調製することができます。 唯一の代謝プローブのために、他の実験前に、細胞挿入またはウェルの2つのシリーズを調製阻害実験のための一連の使用。培地ブランクコントロールとして細胞の第三の系列を準備します。これらは別々のプレート上、または3つの複製の最小と同じプレートであってもよいです。プレートの例が横たわっていましたうち、図5に示されています。 実験の日に、新鮮な培地の450μLで細胞培養培地を交換してください。 無菌フード細胞培養培地を用いて以下の溶液の10倍濃度で調製。 10倍のCYPプローブ、10倍のCYP阻害剤、および10倍のCYP阻害剤に加えて10倍のプローブを混ぜます。 注：阻害剤およびプローブのマスターストック溶液を100％DMSO（ 例えば 、1,000倍ストック）で調製することができ、さらに、細胞培養1％を超える最終DMSO濃度を回避するために10X溶液を得た培地で希釈し。細胞とのインキュベーションを目的としている最終的な1×濃度を表1に示します。 0.2μmのシリンジフィルターと異なる10Xプローブ溶液を濾過します。 阻害実験のために調製した細胞の一連の10倍のCYP阻害剤を含む培地50μLを添加し、30分間プレインキュベートします。 R新鮮な培地を450μLと阻害直列に細胞の培地をeplace両方10X CYP阻害剤を含む培地と10倍のプローブ基板の50μLを加えます。 他のセル10Xプローブ基板と媒体の50μLに加え、 図5に示すように、ブランク細胞対照（ 例えば 、DMSO）中で希釈した車両の当量を加えます。 5分（時間0、バックグラウンド対照）および細胞インキュベーターで16時間 – 0のための細胞をインキュベートします。 注：このインキュベーション時間は、気道細胞および肝細胞株で正常に使用されました。しかし、新鮮な初代肝細胞は、細胞調製物の品質およびドナーの遺伝子構造、したがって、短い時間を保留し、高い代謝能力を持っている（ 例えば 、2〜4時間）が適している可能性があります。常に異なる細胞株または細胞タイプをテストするときに、時間経過実験を行うことをお勧めします。 インキュベーション期間の終わりに、高専ECTプローブの代謝産物の定量のための別個の標識された試験管中の培地。将来の処理のための媒体をフリーズします。 溶解タンパク質定量のための細胞。 注：任意の標準的なタンパク質定量キットおよびプロトコルは、この工程に適しています。 BCAは、一つの適切な選択肢です。細胞は、別のアッセイで使用しなければならない場合、このステップはオプションです。 ミディアム治療 注：インキュベーション段階から回収した培地は、親プローブの化学だけでなく、その代謝産物が含まれています。特定のCYP活性を測定するためにのみ関心のCYPによって触媒反応の生成物を定量化する必要があります。第I相代謝物は、多くの場合、フェーズII代謝（抱合）と並行して処理され、したがって、そのようなとして検出することはできません。したがってCYP活性の最も正確な定量化を得るために、脱抱合工程はいずれかを削除する必要があります第II相代謝修正。フェーズI代謝産物の結合がしばしばグルクロニドまたは硫酸化を含むので、脱抱合は、グルクロニダーゼによるサンプルの処理によって達成18をスルファターゼれます。グルクロニダーゼおよびスルファターゼ活性は、pH 4.5〜5.0およびpH 6.0〜6.5で最高であるスルファターゼ活性で達成される最高グルクロニダーゼ活性を有するpH依存性です。したがって、このステップは、pH調整を必要とします。ほとんどのpH計プローブは、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに収まらないので、ここで説明する方法では、我々は、実際的な理由のためのpHのストリップを用いてpHを測定します。市販のpHストリップは0.3〜0.2のpH単位と低い解像度で見ることができます。 1.5 mLのマイクロチューブに培養培地の250μLを転送および100nMの最終濃度を達成するために4-メチル内部標準ストック溶液を加えます。 1MのHClを添加することによって4.5~5.0に培地のpHを調節します。一度にHClを1μLを追加し、pHを確認pHがストリップ上に媒体の2μLをピペッティングすることによって。 5.0のpH値に到達すると、典型的には1 MのHClのせいぜい5〜10μLを必要としないであろう。 ヘリックスpomatiaからβグルクロニダーゼ/アリールスルファターゼの150単位（85,000単位/ mLのストックの1.8μL）を加え、37℃で1時間インキュベートします。冷メタノール250μLを添加することにより反応を停止し（-20°C）。さらに-20°Cまたはプロセスでサンプルを保管してください。 45℃の真空遠心機を用いて溶媒を蒸発させます。水溶液：30％アセトニトリル500μLのサンプルを再構成します。サンプルは、質量分析のために準備ができているとアンバー・グラスバイアルにおいて-20℃で保存することができます。 質量分析に基づく定量 注：すべてのUPLCおよび質量分析計の設定は、専用の補足表1に詳述されています。定量分析のために、較正曲線を確立することが必要です。カリbration曲線を定量する化合物の公知の希釈範囲を実行することによって得られます。この場合、検量線は線形領域19の20％以内でなければならない、少なくとも6そのうち10種の異なる濃度（ 表2）の上に作製しました。検出の最低レベルは、平均バックグラウンドシグナルを3倍よりも大きい、または等しい信号を与える最低濃度として決定されます。定量の最低レベルが大きい、又は三重サンプルと、少なくとも3つの独立した実験にわたって決定され、どちらも10倍の平均バックグラウンドシグナルに等しいシグナルを与える最低濃度の試料として決定されます。 内部標準を含む、 表2によれば、組織培養培地中で合成代謝物の連続希釈を調製。標準希釈あたり250μLの最終容量は十分です。 STに記載されているように標準の連続希釈液を蒸発させますメディア前蒸発の体積に水当量：30％のアセトニトリルの体積EP 2.1.2.4再懸濁（ 例えば 、250μLの30％アセトニトリル：水出発標準液媒体の250μLであった場合）。 UPLC-MSオートサンプラ内注射用アンバーUPLCガラスバイアルに各連続希釈標準の250μLを追加します。 UPLCバイアルを琥珀とUPLCオートサンプラーでそれらを配置するために試験サンプル（250μL）を追加します。 すべてのバイアルをランダム。 注：我々が使用される質量分析計構成は補足表1に詳述UPLCに結合されたハイブリッドトリプル四重極/リニアイオントラップ質量分析計です。他のプラットフォームには、さまざまなソフトウェアと構成を持っているだろうが、定量化を実行するための同様の手順に従います。 定量化するために特異的なプローブに応じて補足表1に詳述された設定を使用してUPLC-MSを実行します。 つかいます「定量-定量法ビルド」を取得合成標準および内部標準の較正曲線を生成するために、質量分析計定量化ツールのツール（ 材料の表 ）。 「定量方法」を定量化し、実行するために、サンプルのバッチおよびサンプルを選択するために、「定量ウィザード」を使用してください。質量分析計定量化ソフトウェアは、各試験サンプル中の標的化合物の定量値をスプレッドシートを表示します。 発光ベースの方法を使用してプローブ 注：CYP活動の範囲を測定するための発光性プローブは、市販されています。しかし、すべては、セルベースアッセイに適していません。ここでは、プロトコルは、CYP1A1 / CYP1B1の活性を測定するために提示されます。 CYP1A1 / 1B1は、誘導性のCYPの活性をアッセイし、ALTERとして使用することができる方法ルミネセンスプローブの例を与える方法を説明するために選択されました質量分析に基づく方法にネイティブ。 表3は、我々は、気道細胞および肝細胞株のために使用される濃度およびインキュベーション時間をまとめたもの。しかし、それらは他の細胞タイプに適合させることが必要になる場合があります。他の発光性プローブは、市販されているとのCYPの種々の基質として使用することができます。 非誘導対照誘導試験、および誘導+阻害剤の試験を含むように十分な細胞を調製します。プレートレイアウトの例を図5Bに示されています。 CYP1A1を誘導する/ 1B1は、72時間（24〜48時間のより短い期間もまた適切であり得る）の期間中に10nMのTCDDの最終濃度で細胞をインキュベートします。 注意：TCDDは発がん性物質および催奇形性物質です。十分な保護具を着用し、サプライヤーMSDSシートを確認し、使用前にリスク評価を行います。 この期間の後、培地を除去し、PBSで3回ウェルをリンスし、新鮮な培地を加えます。 PRIOR発光性レポータープローブと共に細胞をインキュベートし、培地中で、10μMCYP1A1 / 1B1阻害剤、α-ナフトフラボンの最終濃度で30分間誘導された細胞の指定されたサブセットをプレインキュベートします。 非誘導、誘導し、誘導された+阻害剤を細胞に50μMの最終濃度で、ルミネセンスプローブLUC-CEE（ルシフェリン6'-クロロエチルエーテル）を加えます。 細胞培養インキュベーター中で4時間インキュベートします。インキュベーション時間の終わりに、発光性プローブの定量化のための媒体を集めます。 白色不透明96ウェルプレートに移し、培養培地の25μL、製造業者によって供給されたルシフェリン検出試薬の25μLを加えます。室温で20分間インキュベートします。すぐにルミノメーターを用いてプレートを読みます。 PBSで細胞をリンスし、総タンパク質定量のために溶解。 注：生細胞は将来の実験のために保持されている場合は、このステップはオプションです。私トンは、TCDDなどの誘導物質は毒性があり、細胞を損傷することが注意することが重要です。 表1： その対応する酵素と代謝プローブ、製品、および阻害剤の一覧。分子量及び気道および肝細胞を用い推奨濃度も示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図5：CYPアッセイを行うために24ウェルプレートレイアウトを示唆しました。 （A）構成的に発現のCYPの推奨レイアウトは、ブランク媒体のための一連のウェルを含みます、代謝プローブ、および代謝プローブプラス阻害剤。このレイアウトは、テストされている時点の数を掛けすることができます。 （B）は 、誘導性のCYPための例示的なレイアウトは、媒体ブランクのためのウェルの一連、代謝プローブ（TCDDと例えば 、）のみ制御、誘導された細胞をプローブと共にインキュベートし、プローブおよび阻害剤と共にインキュベートを含みます。 表2： 検量線とそれぞれのLODとLOQsに使用する合成標準の希釈 。使用する希釈範囲は、質量分析プラットフォームと感度に基づいて変えることができます。ここでは、UPLCにリンクされているハイブリッドトリプル四重極/リニアイオントラップ質量分析計を使用していました。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。 表3：CYP1A1 / 1B1アッセイのためにルミネセンスプローブ、誘導物質と阻害剤。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。