В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

Способность визуализировать важные процессы развития в в естественных условиях позвоночных животных способствовало делает данио ключевую модель для изучения нормальных и болезненных условий (обзор в ^{1, 2).} В частности, нейронная сетчатка является доступной частью центральной нервной системы. Сетчатка поддается легко выполнять исследования нейрогенеза в связи с его высокоорганизованной, все же относительно простую структуру, и его высоко консервативных типов нейронов через ³ видов позвоночных. Динамика клеточных поведения, таких как пролиферация, выхода из клеточного цикла, асимметричного деления клеток, спецификации судьбы, дифференциации и формирования нейронной электрической схемы можно проследить на протяжении всего процесса ретиногенеза, который завершается в центральной сетчатки данио на 3 г после оплодотворения ( DPF) ^{4, 5,}исх "> ^{6, 7.}

Кроме того, функциональные требования различных генов в каждом из указанных выше этапов могут быть одновременно оценены в данио сетчатки, обеспечивая преимущество по сравнению с другими позвоночными моделями, в которых фенотипы в результате применения методов нокаут гена может быть оценена только после аутопсии фиксированных тканей. В частности, использование трансгенных линий, в которых мы можем визуализировать и контролировать экспрессию флуоресцентных белков как репортер трансгенов в сетчатке, позволяет получить временное разрешение экспрессии гена, лежащего в основе генезиса определенного нейронного типа клеток. В связи с быстрым развитием данио, эти события могут быть визуализированы в течение всего периода развития, тем самым обеспечивая более глубокое понимание важности временной экспрессии генов в связи с приобретением нейрональной идентичности клеток и поведения клеток.

И, наконец, эти подходы могут быть объединены эффективно в данио рерио, при генерации химер через трансплантаций, в результате проникновения в суть двух ключевых аспектов функции гена. Во-первых, исследуя клетки, пересаженные от донора эмбриона, в котором конкретный ген был нокдаун в то время как они развиваются в среде немеченного дикого типа, позволяет получить необходимую информацию о функции гена в клетке-автономным способом. Это приводит к важным более глубокое представление о функции сетчатки глаза факторов судьбы определителем внутри клеток – предшественников , они , как правило , выражается в. Это можно проиллюстрировать на примере рассмотрения развития исхода судьбы клеток – предшественников , которые больше не могут генерировать функциональный белок из этих генов ^{4, 6, 8, 9.} Используя этот подход, мы показали , что многие судьбы определяющих факторов (например, vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) действуют ячейки-autonomously водить специфические нейронные сетчатку судьбы; отсутствие экспрессии генов в первую очередь , приводит к судьбы переключателя, таким образом, что клетки с геном нокдауна сохраняют жизнеспособность путем принятия альтернативной клеточной судьбы ^{4, 6, 7, 10.} Во-вторых, такие химерные эксперименты могут быть использованы для оценки того, как дикого типа клетки-предшественники ведут себя, когда они развиваются в различных генетических средах. Например, путем сравнения развития клеток WT , которые обычно выражают представляющий интерес ген (и репортер трансгена) в WT в сравнении манипуляций среде хоста (например, ген Нокаут / бросовой), которые воздействуют на экспрессию генов и судьбу клетки могут быть оценены , Отсутствие определенных типов нейронов в принимающей среде, например, было показано, что влияние на поведение клеток-предшественников дикого типа в клетке неавтономных образом, чтобы смещать их к дифференцировке в недопредставленного Oг отсутствуют типы нейронные ^{4, 7, 11, 12.} Учитывая , что нейроны сетчатки рождаются в консервативном histogenic порядке по последовательно приуроченной экспрессии специфических нейрональных генов судьбы определитель (экспрессии генов судьбы) (обзор в ^13), мы использовали эти методы , чтобы продемонстрировать , как выбор времени экспрессии генов судьба в предшественниках дикого типа влияет, когда такие клетки-предшественники развиваются в сетчатку средах хозяев с индуцированными аберрантных клеточных композиций. Здесь мы опишем эти подходы в качестве доказательства для того, как сочетание относительно стандартных и широко используемых методов позволяет изучение сроков экспрессии генов судьбы в развитии клеток – предшественников ретинальных ^{8, 9.}

Этот протокол описывает экспериментальный подход, включающий покадровой обработки изображений с легкостью вформирование трансплантации в естественных условиях экс развивающегося эмбриона данио следовать отдельному мозаично меченых клеток на протяжении всего периода ретиногенеза развития. Выполняя функциональные манипуляции генов либо в принимающем зародыша, донора эмбриона, оба или ни, можно оценить автономию клеток функции гена. Такой подход может быть широко адаптировано для аналогичных исследовательских вопросов в любой другой системе, для которых отдельные компоненты, описанные здесь, являются подходящими.