Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE
Summary
Questo documento presenta un protocollo per l'elaborazione di immagini cryo-EM utilizzando la suite software SPHIRE. Il presente protocollo può essere applicato per quasi tutti i progetti di singoli particelle EM che mirano ad una risoluzione quasi atomica.
Abstract
SPHIRE (SPARX per la microscopia elettronica ad alta risoluzione) è una nuova suite software open-source per l'elaborazione semi-automatizzata di dati criomicroscopia elettronica a particelle singole (cryo-EM). Il protocollo qui descritto descrive dettagliatamente come ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica a partire dai film di micrografia di cryo-EM guidando gli utenti attraverso tutti i passaggi della pipeline di determinazione della struttura delle particelle singole. Questi passaggi sono controllati dalla nuova interfaccia grafica SPHIRE e richiedono un intervento minimo da parte dell'utente. Utilizzando questo protocollo, una struttura di 3,5 Å di TcdA1, un complesso Tc toxin da Photorhabdus luminescens , è stato derivato da soli 9500 particelle singole. Questo approccio semplificato aiuterà gli utenti novizi senza un'estesa esperienza di elaborazione e informazioni strutturali a priori , per ottenere modelli atomici senza rumori e imparziali dei loro complessi macromolecolari purificati nel loro stato nativo.
Introduction
Dopo lo sviluppo della tecnologia di rivelazione diretta dell'elettrone, il notevole progresso nella singola particella cryo-EM sta attualmente riformando la biologia strutturale 1 . Rispetto alla cristallografia a raggi X, questa tecnica richiede solo una piccola quantità di materiale proteico senza la necessità di cristallizzazione, mentre contemporaneamente pone minori restrizioni riguardanti la purezza del campione e consente comunque la determinazione di strutture a risoluzione quasi atomica. Importante, diverse composizioni o stati possono ora essere separati in modo computazionale e la determinazione della struttura delle diverse conformazioni può essere effettuata a livello di dettaglio senza precedenti. Recentemente, mappe di densità di molecole impegnative potrebbero essere prodotte a risoluzioni che permettono di costruire modello di de novo e quindi una profonda comprensione del loro modo di azione 2 , 3 , 4 , 5.
Una vasta gamma di pacchetti software per l'elaborazione delle immagini è disponibile nella comunità 3DEM (Microscopia Elettronica 3D) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) e la maggior parte di esse è in continua evoluzione. La risoluzione quasi atomica è stata raggiunta per le proteine che presentano varie pesi molecolari e simmetrie con diversi pacchetti software diversi, tra cui EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 e SPARX 11 . Ogni pacchetto richiede un diverso livello di competenza dell'utente e fornisce un diverso livello di guida, automazione e estensibilità dell'utente. Inoltre, mentre alcuni programmi forniscono ambienti completi per facilitare tutte le fasi dell'analisi delle immagini, altre sono progettate per ottimizzare le attività specifiche, come la perfezionamento dei parametri di allineamento a partire da un rStruttura di eference. Più di recente, sono state sviluppate diverse piattaforme, tra cui APPION 12 e SCIPION 13 , che forniscono una singola pipeline di elaborazione che integra approcci e protocolli dai vari pacchetti software elencati in precedenza.
Per contribuire allo sviluppo attuale di cryo-EM, SPARX è stato rielaborato in una nuova piattaforma autonoma e completa per l'analisi di particelle singole, denominata SPHIRE (SPARX per microscopia elettronica ad alta risoluzione). Al fine di aumentare l'accessibilità della tecnica per i nuovi ricercatori sul campo e per far fronte alla grande quantità di dati prodotti dai moderni microscopi elettronici high-end completamente automatizzati, la pipeline di trasformazione è stata ridisegnata e semplificata introducendo un facile utilizzo Interfaccia utente grafica (GUI) e automatizzazione dei passaggi principali del flusso di lavoro. Inoltre, sono stati aggiunti nuovi algoritmi per consentire la determinazione della struttura veloce, riproducibile e automatizzata dalla crImmagini yo-EM. Inoltre, è stata introdotta la convalida per riproducibilità al fine di evitare artefatti comuni prodotti durante l'analisi di raffinatezza e di eterogeneità.
Anche se il programma è stato ampiamente modificato, le sue caratteristiche fondamentali sono state mantenute: un semplice codice open-source, il moderno design orientato agli oggetti e le interfacce Python per tutte le funzioni di base. Pertanto, non è stato modificato in un programma a scatola nera, che consente agli utenti di studiare e modificare facilmente il codice Python, per creare applicazioni aggiuntive o modificare il flusso di lavoro complessivo. Ciò è particolarmente utile per progetti non standard di cryo-EM.
Qui presentiamo un protocollo per ottenere una mappa di densità vicino alla risoluzione atomica da immagini cryo-EM usando la GUI di SPHIRE. Descrive in dettaglio tutti i passaggi necessari per generare una mappa di densità dai film di rivelatore diretto crudo-EM e non è limitata a qualsiasi tipo di macromolecole particolare. Questo protocollo mira principalmente a guidare newcOmers nel campo attraverso il flusso di lavoro e fornire informazioni importanti su passaggi cruciali dell'elaborazione così come alcune delle possibili trappole e ostacoli. Le caratteristiche più avanzate e lo sfondo teorico che sta alla base di SPHIRE saranno descritti altrove.
Protocol
Representative Results
Discussion
La singola particella cryo-EM ha mostrato un rapido sviluppo negli ultimi anni e ha fornito numerose strutture di risoluzione atomica di complessi macromolecolari di rilevante significato biologico 25 . Per supportare il gran numero di nuovi utenti che stanno attualmente entrando nel campo, abbiamo sviluppato la singola piattaforma di analisi delle immagini di particelle SPHIRE e presentato qui un protocollo di passaggio per l'intero flusso di lavoro, tra cui l'allineamento del film, la raccolta delle particelle, la stima CTF, il modello iniziale Calcolo, analisi di eterogeneità 2D e 3D, raffinatezza 3D ad alta risoluzione e stima e filtraggio di risoluzione locale.
Il protocollo qui descritto è inteso come una breve guida alla determinazione della struttura 3D utilizzando micrografi criomem-EM della proteina di interesse e con l'ausilio di strumenti di calcolo forniti dalla GUI stand-alone di SPHIRE.
La caratteristica principale del flusso di lavoro è quella piùDelle procedure devono essere eseguite solo una volta, poiché si basano sul concetto di convalida per riproducibilità 19 e non richiedono modifiche ai parametri. Questo meccanismo di convalida automatica è un vantaggio principale di SPHIRE rispetto ad altri pacchetti software poiché i risultati tendono ad essere obiettivi e riproducibili e, soprattutto, ottenibili con un costo accettabile di calcolo. La pipeline fornisce inoltre una grande quantità di informazioni diagnostiche per gli utenti esperti per condurre ulteriori convalida e valutazione indipendenti con metodi propri. Tuttavia, un utente novizio che ha almeno la priorità teorica elementare nella biologia strutturale e nella microscopia elettronica dovrebbe essere in grado di ottenere strutture di risoluzione quasi atomiche utilizzando i propri dati e le procedure di convalida automatica.
Tuttavia, ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica non è sempre semplice e il risultato dipenderà fortemente dalla qualità del campione e dall'ingressoun. Per le procedure qui presentate, si presume che siano disponibili un numero sufficiente di filmati EM di alta qualità non coordinati, con le loro medie che mostrano particolari particelle omogenee e casuali orientate in modo chiaro. In generale, non ci sono restrizioni riguardo alla simmetria, alla dimensione o alla forma complessiva della molecola, ma un basso peso molecolare può essere un fattore limitante, specialmente quando la proteina ha una forma globulare senza caratteristiche. Di solito, l'analisi di particelle più grandi e ben ordinate con elevata simmetria di punti-gruppo è meno esigente. Pertanto, è fortemente raccomandato agli utenti novizi di eseguire il presente protocollo innanzitutto con un set di dati crio- I dati del tutorial SPHIRE (http: /sphire.mpg.de) o uno dei set di dati inviati da EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) con i filmati crudi sono un buon punto di partenza .
Quando si elaborano dati propri, è molto probabile che alcuni set di dati o alcune delle immagini non soddisfino certe qualitàI criteri. In questo contesto, oltre ai controlli automatici di stabilità e riproducibilità, eseguiti dal programma per i principali passaggi del flusso di lavoro, è ancora raccomandato agli utenti di controllare visivamente i risultati in alcuni "punti di controllo" del protocollo, soprattutto se la ricostruzione finale Non è soddisfacente.
La prima ispezione visiva può essere eseguita a livello di micrografia dopo l'allineamento del film (protocollo step 2 ) e la stima CTF (protocollo step 3 ). Le medie corrette a correzione del movimento dovrebbero mostrare particelle singole chiaramente distinguibili e ben separate e gli spettri di potenza dovrebbero mostrare chiaramente elencati isonotici Thon. La frequenza spaziale a cui sono visibili definisce nella maggior parte dei casi la più alta risoluzione a cui la struttura può in linea di principio essere determinata. Esempi di una media corretta di movimento di qualità sufficiente e dello spettro di potenza sono mostrati nella sezione & #34; Risultati rappresentativi ". Le immagini estranee che potrebbero avere un impatto negativo sul risultato finale possono essere rimosse con l'aiuto di strumenti di GUI di valutazione di Drift e CTF di SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
Per quanto riguarda lo screening delle particelle, il passo cruciale nella pipeline SPHIRE è la classificazione 2D che utilizza ISAC ( Protocol step 5.2) . Qui l'utente deve controllare che le medie di classe 2D riproducibili identificate automaticamente dal programma adottino una gamma di orientamenti sufficienti a coprire quasi nello spazio angolare. Se la qualità delle medie di classe non è soddisfacente (immagini rumorose e / o sfocate) e / o il numero di medie di classe riproducibili è molto basso, si consideri il miglioramento della qualità di selezione automatica, l'ottimizzazione dell'immagine dei dati o la preparazione del campione. Nella maggior parte dei casi, non è possibile calcolare una ricostruzione affidabile da un set di dati che non presenta buone medie di classe 2D. Esempi di ave di classe 2D di alta qualitàI disturbi sono riportati nella sezione "Risultati rappresentativi".
Almeno 100 medie di classe sono necessarie per ottenere un modello 3D iniziale affidabile utilizzando RVIPER in modo automatizzato (protocollo step 6.1 ). Per questo passo, l'utente deve selezionare le medie con la massima qualità e includere il maggior numero di orientamenti della particella possibile. La qualità del modello iniziale è fondamentale per il successo del successivo raffinamento 3D ad alta risoluzione.
In altri pacchetti software, talvolta viene eseguita una classificazione 3D per eliminare le particelle "cattive" 8 , 9 . Tuttavia, in SPHIRE la maggior parte di queste particelle vengono eliminate automaticamente già durante la classificazione 2D usando ISAC. Pertanto si raccomanda di eseguire il passaggio computazionale intensivo della classificazione 3D solo se la ricostruzione e l'analisi della variabilità 3D indicano l'eterogeneità del set di dati.
Ancora più importante, l'utente deve sempre accuratamente controllare con attenzione i volumi 3D risultanti (protocollo step 9.3 ) e confermare che le caratteristiche della rispettiva densità sono d'accordo con la risoluzione nominale. A una risoluzione di <9 Å, le densità ad asta corrispondenti alle α-eliche diventano visibili. A una risoluzione <4,5 Å, le densità corrispondenti ai fili in fogli β sono normalmente ben separati e gli amminoacidi ingombranti diventano visibili. Una mappa ad alta risoluzione (<3 Å) dovrebbe mostrare chiare catene laterali, permettendo così di costruire un modello atomico accurato.
I risultati ottenuti finora dimostrano che, con l'aiuto dei test di riproducibilità automatica SPHIRE e delle ispezioni visive minime, il presente protocollo è generalmente applicabile a qualsiasi tipo di progetto singolo criomem. I risultati rappresentativi di ogni fase di elaborazione sono mostrati per la ricostruzione della tossina TcdA1 diPhotorhabdus luminescens 21 , che è stato risolto a risoluzione quasi atomica. Le mappe di densità di qualità simile possono essere utilizzate per costruire modelli atomici affidabili dalla traccia di spina dorsale de novo così come la raffinatezza reciproca o reale, e quindi fornire un quadro strutturale solido per la comprensione di meccanismi molecolari complessi.
CODICI DI ACCESSIONE:
Le coordinate per la struttura EM ei film non elaborati sono stati depositati rispettivamente nella banca dati elettronica di microscopia e nell'immagine pilota di microscopia elettronica sotto i numeri di accesso EMD-3645 e EMPIAR-10089.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo D. Roderer per aver fornito micrografi TcdA1. Ringraziamo Steve Ludtke per il suo costante supporto all'infrastruttura EMAN2. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi della Società Max Planck (SR) e del Consiglio Europeo nell'ambito del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7 / 2007-2013) (concedo n. 615984) (a SR) e concessione da parte degli istituti nazionali di Salute R01 GM60635 a PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
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