小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価
Summary
このプロトコルは、神経科学および神経薬理学研究のインビトロモデルとして使用される初代ニューロン培養物である培養小脳顆粒ニューロンにおけるフルオレセインジアセテート（FDA）およびヨウ化プロピジウム（PI）二重染色を使用してニューロン生存度を正確に測定する方法を記載する。
Abstract
一次培養小脳顆粒ニューロン（CGN）は、神経科学および神経薬理学研究におけるインビトロモデルとして広く使用されている。しかし、CGN培養におけるグリア細胞とニューロンの共存は、ニューロン生存率の正確な評価において偏りを引き起こす可能性がある。生きた細胞と死んだ細胞を同時に評価することにより、細胞の生存率を測定するために、フルオレセインジアセテート（FDA）およびヨウ化プロピジウム（PI）の二重染色が用いられてきた。我々は、比色アッセイの感度を改善し、CGNにおけるニューロン生存度を評価するために、FDA-PI二重染色を使用した。さらに、精度を向上させるため青色蛍光DNA染色剤（Hoechstなど）を追加しました。このプロトコルは、CGN培養においてこれらの方法を使用することによって、ニューロン生存度の評価の精度を改善する方法を記載する。このプロトコルを使用して、グリア細胞の数は、蛍光顕微鏡を使用することによって除外することができます。同様の戦略を適用して、望ましくないgli例えば、一次皮質培養および海馬培養のような種々の混合細胞培養物中のニューロンから得た。
Introduction
3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイなどの比色細胞毒性アッセイは、インビトロで細胞生存度を測定するために一般的に使用される。ラット由来の初代培養小脳顆粒ニューロン（CGN）は、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン、過酸化水素、グルタミン酸塩などの様々な神経毒に感受性である1,2。したがって、CGN培養物は、神経科学の分野におけるインビトロモデルとして使用することができる。 CGN培養物は、CGN培養物中の全細胞の約1％を占めることができるニューロンおよびグリア細胞を含む種々の細胞を含み得る。しかし、グリア細胞は、ニューロンと比較して神経毒とは異なる応答を示し、比色アッセイによって測定されたニューロン生存率の偏りをもたらす3 。
生存細胞では、フルオレセインジアセテート（FDA）はエステラーゼによってフルオレセインに変換することができる。ヨウ化プロピジウム（PI）は、死んだ細胞に浸透した後にDNAと相互作用することができ、培養内のアポトーシスを示すために使用することができる。したがって、FDA-PI二重染色は、生存細胞および死細胞を同時に評価することができ、両方の比色法を組み合わせることにより細胞生存率をより正確に測定できることを示唆している。さらに、核の青色蛍光染色であるHoechstを添加することにより、細胞生存率の精度をさらに向上させることができた。ここに提示されたプロトコールは、初代培養CGNにおけるニューロン生存度を正確に分析するために使用できるFDA-PI二重染色およびFDA-PI-Hoechst三重染色を記載する。
このプロトコールは、CGNおよびグリア細胞を異なる大きさおよび形状で視覚化および区別することを利用する。染色後、生存可能なニューロンおよび死んだニューロンの数を、蛍光顕微鏡で撮影した代表的な画像から数えた。大型グリア細胞は、典型的なCGNsの比較によって排除される蛍光モードの下で位相差モードで撮影されたものである。同様の戦略を実施して、一次皮質培養および海馬培養などのニューロンおよびグリア細胞を含む混合細胞培養物におけるニューロン生存度を測定することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、以前に記載された手順6,7から修正された。研究者らは、インビトロで初代ニューロンを培養する際の条件を改善することによって、非神経細胞成長を減少させるために時間を費やしている8 。しかし、培養条件が改善されても、いくつかのグリア細胞が残る。さらに、非ニューロン細胞は、ニューロンの成長および成熟に役立つため、初?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、浙江省自然科学財団（LY15H310007）、浙江省非営利研究プロジェクト（2016C37110）、中国国立自然科学財団（U1503223,81673407）、寧波国際科学研究院広東省国際科学技術協力プロジェクト（No. 2013B051000038）、深セン基礎研究プログラム（JCYJ20160331141459373）、広東省洪水技術協力プロジェクト（2014D10019）、寧波市のライフサイエンス・イノベーション・チーム（2015C110026） （GHP / 012 / 16GD）、香港の研究助成協議会（15101014）、香港工科大学（G-YBGQ）、寧波大学のKCウォン・マグナ基金などがあります。
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
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