Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.
Abstract
Primärkultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) wurden weithin als In-vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet. Allerdings könnte die Koexistenz von Gliazellen und Neuronen in der CGN-Kultur zu Vorspannungen bei der genauen Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit führen. Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) -Phasenfärbung wurde verwendet, um die Zelllebensfähigkeit durch gleichzeitiges Auswerten der lebensfähigen und toten Zellen zu messen. Wir verwendeten FDA-PI-Doppelfärbung, um die Empfindlichkeiten der kolorimetrischen Assays zu verbessern und die neuronale Lebensfähigkeit in CGNs zu bewerten. Darüber hinaus haben wir blau fluoreszierende DNA-Flecken ( zB Hoechst) hinzugefügt, um die Genauigkeit zu verbessern. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Genauigkeit der Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit durch die Verwendung dieser Methoden in CGN Kultur zu verbessern. Mit diesem Protokoll kann die Anzahl der Gliazellen durch die Fluoreszenzmikroskopie ausgeschlossen werden. Eine ähnliche Strategie kann angewendet werden, um das unerwünschte Gli zu unterscheidenAl-Zellen aus Neuronen in verschiedenen gemischten Zellkulturen, wie primäre kortikale Kultur und Hippocampalkultur.
Introduction
Farbmetrische zytotoxische Assays, wie der 3- (4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -Assay, werden üblicherweise zur Messung der Zelllebensfähigkeit in vitro verwendet. Primäre kultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) von Ratten sind empfindlich gegenüber verschiedenen Neurotoxinen, einschließlich 1-Methyl-4-phenylpyridiniumionen, Wasserstoffperoxid und Glutamat 1 , 2 . Daher können CGN-Kulturen als In-vitro- Modell im Bereich der Neurowissenschaften eingesetzt werden. CGN-Kulturen können eine Vielzahl von Zellen enthalten, einschließlich Neuronen und Gliazellen, die etwa 1% der gesamten Zellen in der CGN-Kultur ausmachen können. Allerdings reagieren Gliazellen anders als Neurotoxine im Vergleich zu Neuronen, was zu einer Vorspannung in der neuronalen Lebensfähigkeit führt, gemessen durch kolorimetrische Assays 3 .
In lebensfähigen Zellen kann Fluorescein-Diacetat (FDA) durch Esterase in Fluorescein umgewandelt werden.Propidium-Iodid (PI) kann mit der DNA nach dem Durchdringen von toten Zellen interagieren und kann verwendet werden, um Apoptose innerhalb der Kultur anzuzeigen. Daher kann die FDA-PI-Doppelfärbung gleichzeitig lebensfähige Zellen und tote Zellen auswerten, was darauf hindeutet, dass die Zelllebensfähigkeit durch Kombination von kolorimetrischen Methoden genauer gemessen werden kann. Darüber hinaus könnte durch die Zugabe von Hoechst, einem blauen Fluoreszenzfleck für Kerne, die Genauigkeit der Lebensfähigkeit der Zellen weiter verbessert werden. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die FDA-PI-Doppelfärbung und die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung, mit der die neuronale Lebensfähigkeit in primär kultivierten CGNs genau analysiert werden kann.
Dieses Protokoll nutzt die Visualisierung und Unterscheidung von CGNs und Gliazellen durch ihre unterschiedlichen Größen und Formen. Nach der Färbung werden die Anzahl der lebensfähigen Neuronen und toten Neuronen aus repräsentativen Bildern der Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Die großformatigen Gliazellen werden durch den Vergleich typischer CGNs t ausgeschlossenUnter dem Fluoreszenzmodus mit denen, die unter Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden. Eine ähnliche Strategie kann durchgeführt werden, um die neuronale Lebensfähigkeit in gemischten Zellkulturen zu messen, die Neuronen und Gliazellen enthalten, wie primäre kortikale Kulturen und Hippocampalkulturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde von Prozeduren modifiziert, die zuvor beschrieben wurden 6 , 7 . Forscher haben Zeit damit verbracht, das nicht-neuronale Zellwachstum zu reduzieren, indem sie die Bedingungen bei der Kultivierung primärer Neuronen in vitro verbessern. Doch auch bei verbesserten Kulturbedingungen bleiben einige Gliazellen erhalten. Darüber hinaus sind nicht-neuronale Zellen in primären neuronalen Kulturen notwendig, weil sie mit neuronalem Wach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Zhejiang (LY15H310007), dem angewandten Forschungsprojekt zur gemeinnützigen Technologie der Provinz Zhejiang (2016C37110), der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (U1503223, 81673407), der Ningbo International Science und Technology Cooperation Project (2014D10019), die Ningbo Municipal Innovation Team of Life Science und Gesundheit (2015C110026), die Guangdong Provincial International Cooperation Projekt der Wissenschaft und Technologie (Nr. 2013B051000038), die Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20160331141459373), die Guangdong-Hong Kong Technology Cooperation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), der Forschungsstipendienrat von Hongkong (15101014), die Polytechnische Universität Hongkong (G-YBGQ) und der KC Wong Magna Fund an der Ningbo University.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
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