细胞外基质衍生的泡沫和微载体如组织特异性细胞培养和交付平台的制造

1.脱细胞组织处理脱细胞和冰冻干燥以下建立的协议的感兴趣组织脱细胞化（多个）。 注：支架在目前的研究已准备按照公开的脱细胞协议人类DAT 28，猪DDT 8，和猪DLV 32。市售的不溶性胶原，也可用于制造泡沫和微载体，例如胶原蛋白从牛腱，其已经成功地用于在10的浓度范围源 – 50毫克/毫升。其它不溶性胶原源可以被利用，但可能需要优化以识别的浓度范围内，这将产生稳定的支架。 转移水合脱细胞化组织或纯化的胶原到50mL离心管中与钳，并添加足够的双蒸水（DDH 2 O）以浸没所述组织，叔的35毫升OA最大总体积。 过夜冷冻样品在-80℃下，有冻随后冻干期间最大限度地为升华的表面积期间水平定位在所述离心管中。 取下离心管盖和冷冻样本转移到冻干瓶中。 72小时或直至完全干燥 – 使用实验室冷冻干燥器48冻干样品。 注：干燥时间可以为不同的冻干机和脱细胞组织而变化。 精细地剁碎冻干ECM成小块-使用锋利的外科剪刀（〜1 2 立方毫米）。 存放在干燥器中碎ECM直到准备进行进一步的处理。 注：建议将切碎ECM可以立即使用，以防止对环境吸潮。 低温研磨（可选泡沫制造） 填有25毫升不锈钢研磨室用于laboratoRY球磨机系统剁碎冻干ECM​​并添加两个10毫米的不锈钢研磨球。 关闭和完全浸没在液氮中所装载的研磨室3分钟。 磨机以30Hz（1800 rpm）的3分钟的冷冻样本。 直到ECM磨成细粉重复步骤1.2.2和1.2.3。 注意：次这些步骤应重复可以ECM来源之间变化的数量。例如，DAT通常需要3个铣削循环，以产生细粉。 转移使用scoopula到玻璃小瓶中的粉末，紧密地密封，并在干燥器中储存。 ECM悬浮液的制备称出250毫克或者剁碎（为泡沫）或低温研磨的（对于泡沫或微载体）的ECM并将其转移至15mL离心管中。分别指到步骤1.1.6和1.2节的制备切碎的ECM和低温研磨ECM的，。 注意：此协议被设计以制备50mg / mL的ECM suspen锡永，它被推荐用于人类DAT，猪DDT和猪DLV。这取决于特定的ECM源上，也可以在更高或更低的起始浓度来产生均匀的悬浮液。 添加的0.22摩尔的NaH 2 PO 4（pH为5.4）缓冲液中至离心管中，并标记在管中的液位5毫升。 通过加入7.5毫克α淀粉酶的1毫升0.22摩尔的NaH 2 PO 4（pH为5.4）缓冲液制备的α淀粉酶储液。添加α淀粉酶原液的100μL（0.75毫克α淀粉酶; 0.3％w / w的干的组织）到样品中。添加0.22摩尔的NaH 2 PO 4，得到10 mL的最终体积。 以300rpm在室温下72个小时连续地搅拌该悬浮液。 离心悬浮液在1500×g离心10分钟。小心收集并弃去上清液而不扰乱消化ECM颗粒。重悬在10毫升的5％的NaCl的沉淀材料在DDH 2 O稀释总共两次漂洗，用5％的NaCl在DDH 2 O重复步骤1.3.5 弃上清，重悬沉淀材料在10毫升的DDH 2 O的连续搅拌该悬浮液以300rpm在室温下10分钟。 离心悬浮液在1500×g离心10分钟。小心收集并弃去上清液而不扰乱消化ECM颗粒。 添加0.2M的乙酸的5毫升标记在步骤1.3.2制成。 连续搅拌该悬浮液以120rpm O / N在37℃。 在均质化使用配备有锯齿10mm宽的探针，直到没有可见的碎片残留的手持均化器10秒的时间间隔在室温下将悬浮液ECM。放置在悬浮液的冷水均化间隔之间的烧杯以防止过热。 注意：根据所述ECM源上，在0.2M的乙酸进一步稀释，可能需要以获得均匀的悬浮液。 Ë所述ECM悬浮液xcessive冷却会导致粘度的增加可与有效均化干扰。如果粘度增加注意，可将样品复温至37℃，并进行进一步的处理。 储存于4℃下之前泡沫或微载体制造长达一个月。 2. ECM-源性泡沫制造在37℃连续搅拌孵育从步骤1.3.13的ECM悬浮液（切碎或低温研磨）以120rpm，直到悬浮液是温暖的。 稀释在0.2M乙酸的ECM酸性悬浮液至所需浓度。 注意：根据所述ECM来源的，稳定的泡沫体可以在10的范围内制备 – 100毫克/毫升，用15 – 50毫克/毫升，作为DAT，DDT和DLV的建议范围。通常，在较高浓度下制造的泡沫将稍微少多孔但在培养物中更稳定和更容易处理。 使用3毫升注射器瓦特第i个18号针以防止在ECM悬浮气泡形成，填充与ECM悬浮液所需的模具。为了制造DAT，DDT，和DLV泡沫，分配400μL的35毫克/毫升悬浮液ECM到48孔细胞培养物处理的板。 注意：所选择的模具的形状和ECM悬浮液的体积，将决定所得到的泡沫的几何形状。 覆盖，并通过将它们放置在一个-20℃或-80℃冰箱中过夜冷冻的模具。 注：冻结的温度可能会影响泡沫的孔隙率。当样品在-20℃下冷冻相比，-80℃下，由于较大的冰晶33的形成预计更大的孔。制造具有均匀的多孔结构的泡沫，确保模具不与导电表面，以防止定向冷却接触。 将包含冷冻样本到冻干机烧瓶中的模具。冻干机瓶连接到实验室及其他实验室ORY冷冻干燥器系统和干燥24个小时。 注：重要的是，样品保持冻干之前冻结。 存储冻干泡沫在干燥器中备用。 通过电喷3. ECM来源的微载体制备注：建立电喷雾的概述示于图2。 与在100rpm O / N连续搅拌孵育从步骤1.3.13的低温研磨ECM悬浮液在37℃下。 注：低温研磨ECM被用于制造ECM来源的微载体，以确保在该悬浮液更均匀，并防止电喷射期间堵塞。 负载3毫升ECM悬浮到3mL的路厄氏锁注射器的并附加有翼输注设置在注射器的孔中。 注：针规的范围，可以使用识别出选择可影响所得到的微载体的尺寸和形状。为了fabricatE中的DAT，DDT，以及微载体DLV，使用25号针。 安全注射泵内的注射器。紧固针到铁架台，并在4:1的距离针尖垂直定位 – 6厘米从低形式杜瓦瓶的顶部（250 – 500推荐毫升大小范围）。 附加弹簧夹电极到针的尖端并把它连接到所述高电压电源的正极端子。 折叠铝箔（12×5厘米）的条带在真空瓶的边缘。 附加一个第二弹簧夹电极箔的外边缘，并将其连接到电源的接地源极端子。 用液氮杜瓦瓶填以从顶部大约1厘米，从而使3/4箔片被淹没。 注意：保持充满液氮的杜瓦瓶是很重要的。液氮的表面必须在电喷雾PROCES不大于从烧瓶的顶部2厘米少秒。液氮的连续再填充是必需的电喷射期间维持恒定的水平。 设定注射器泵以30毫升/小时的输注速率。 注：改变输注速率可以改变微载体的形状和直径，但是推荐的范围是25 – 35毫升/小时。虽然它是高度地依赖于悬浮液的粘度，低于25毫升/小时的流速可能导致较大的微载体的产生。在非常低的流量，微载体的大小和形状可能变得不那么均匀。在输注速率高于35毫升/小时， 通过电喷雾产生的液滴的均匀性可能被破坏，从而导致非球形的微载体具有更宽的粒度分布34。 应用20千伏的电压并打开注射泵启动电喷雾。 注：电压可以变化，以调节所述微载体的尺寸和趋向于对直径比infusio产生更大的影响氮肥用量。推荐的电压范围为15 – 25千伏。在微载体直径的减小预期的增加电压35。 一旦输注完成后，小心地倒出从杜瓦过量液氮，留下悬浮在约25mL液体氮的微载体，以确保它们保持冷冻。 立即以平滑的动作转移浇注用液氮到50mL离心管中，微载体。收集剩余的杜瓦用scoopula冰冻微载体，并将其添加到离心管中。 注意：根据所述杜瓦瓶的大小，在液氮中的微载体可以是最初注入中型容器中，然后立即转移到50毫升离心管中。 覆盖包含在与在冻干制剂小孔穿孔铝箔液氮微载体的离心管中。 将覆盖离心机管放入冻干器烧瓶中。立即连接到烧瓶冻干机和干燥样品O / N。 注：这是保持悬浮在液态氮，以确保他们没有这一步之前解冻微载体非常重要，因为融化可能导致崩溃和/或聚集。使用上述的电喷雾条件中的35毫克/毫升的浓度制成DAT，DDT和DLV微载体典型地将具有一种水合直径范围350之间 – 在大小为500μm。尺寸分布可以根据所述ECM来源的不同而不同。 存储冻干微载体在干燥器中备用。 图2.概述微载体制造中使用的电喷雾装置的。 一个 ：图片示出密钥电喷雾设备，包括注射泵的布置和高压电源，以及相对于液氮的杜瓦针的定位。 B：电喷射原理图，包括用于电压，输注速率和距离在建议范围。 请点击此处查看该图的放大版本。 4.制备泡沫和微载体用于细胞培养的补液转移用钳子冻干泡沫到含有过量的无水乙醇（〜99.9％）的50mL离心管中（约5：1的比例的乙醇，以泡沫）。类似地，重悬用于收集原始离心管内的过量的无水乙醇的冻干微载体。使用血清移液管，过滤器通过具有限定目尺寸不锈钢筛微载体进入一个新的50毫升离心管中，以去除任何聚集体并选择所需的尺寸范围。注意：如果泡沫TCPS板内制成，它们可以直接这些血管内再水化。 孵育在4℃下4个小时或直至泡沫或微载体具有重力沉降至离心管的底部。执行使用无菌的试剂和适当的无菌技术在层流罩的所有后续步骤。 使用血清移液管除去无水乙醇，并添加过量（5：1的比例）的95％乙醇，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释至支架。孵育在4℃下4个小时或直至ECM来源的支架已经沉没到补液容器的底部。 通过乙醇系列（90，85，80，75，70，50，25和0％，用无菌PBS稀释）逐渐再水合支架。在每一步，在孵育4℃，直到支架具有改变溶液之前沉到容器的底部。脱气下光真空支架如果支架内形成气泡是OBServed。 更换无菌PBS额外冲洗两次以去除残留的乙醇。 储存在100％无菌PBS在4℃下，直到准备用于细胞培养。以下补液2个星期 – 使用1内的支架。 用于细胞接种制备上播种前一天，转移使用镊子的泡沫体成细胞培养物处理的孔板或transwell插入并添加足够的细胞培养基（基于感兴趣的细胞类型选择），以完全浸没的支架（ 例如，2.5毫升/支架中12孔平板）。类似地，允许微载体沉降重力离心管内，小心使用血清移液管，而不会干扰所述微载体移除PBS，并添加细胞培养基以达到5：介质的至微载体1的比例。 注：对于接种人类的ASC，利用Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM）：Ham氏F12营养混合物补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 – 链霉素。 总共一个漂洗的更换细胞培养基。 平衡在细胞培养基中的支架过夜，在37℃。该支架将准备细胞接种的第二天。 注：泡沫可以静态地接种在细胞培养插入物或组织培养孔板29，或使用实验室摇动器36动态地接种。根据不同的ECM来源，加工方法和悬浮液浓度上，动态播种可提高初始细胞附着，增殖和浸润。微载体可以动态地使用旋涂器培养系统11接种。