Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie
Summary
Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Beperkende verdunning analyses van antilichaam uitscheidende cellen precursorfrequentie suggereren dat B-cellen reactief voor een bepaald antigeen kenmerkend optreden met een frequentie van 0,05-0,005% in de normale repertoire, afhankelijk van de status vaccinatie en grootte / het aantal aanwezige epitopen op het antigeen. De lage frequentie van deze cellen is het moeilijk om veranderingen in de status tijdens de ontwikkeling van immuunresponsen, zoals na vaccinatie en blootstelling aan een vreemd antigeen, of tijdens de ontwikkeling van auto-immuniteit te bestuderen. Eerder hebben onderzoekers isolatie van antigeen-reactieve B-cellen met behulp van technieken variërend van antigeen beklede platen of kolom adsorptiemiddelen, op met antigeen beklede rode bloedcellen resetten om uitgevoerd fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though deze technieken zijn succesvol bij het identificeren en isoleren van antigeen-reactieve B-cellen zijn, zijn de resultaten variëren qua opbrengst, zuiverheid en schaalbaarheid. Onlangs hebben we een nieuwe methode om zowel te detecteren en te verrijken zeldzame B lymfocytensubpopulaties met magnetische nanodeeltjes. De methode kan verrijken met een relatief hoge opbrengst en zuiverheid van grote populaties starten, en is compatibel met de analyse van de reacties op antigeen. Door verrijken van populaties van cellen in suspensie, waarbij de werkwijze elimineert beperkingen die samenhangen met de geometrie van de met antigeen beklede platen of kolommen, en beperken doorvoer. Tenslotte, aangezien verrijkte cellen geassocieerd blijven met antigeen en een fluorescerende reporter, kunnen verder worden gezuiverd door FACS-sortering. Zoals hierin beschreven hebben we deze benadering voor onderzoek van perifeer bloed tetanustoxoïde-reactieve B-cellen voor en na immunisatie van menselijke patiënten, evenals autoantigeen-reactieve B-cellen van patiënten met verschillende autoi gebruiktmmune aandoeningen, waaronder type 1 diabetes, de ziekte van Graves, en de ziekte van 7 Hashimoto. De werkwijze werkt evengoed bij muis en mens, en is compatibel met de analyse van antigeen-reactieve B-cellen van verschillende weefsels (manuscript in voorbereiding).
In de basisopstelling weergave worden perifeer bloed mononucleaire cellen eerst geïncubeerd met gebiotinyleerd antigeen met antilichamen tegen oppervlakteantigenen vereist voor fenotypische analyse cel. Deze etikettering wordt gevolgd door wassen en fixatie, en toevoeging van streptavidine gekoppeld met ver-rood-fluorescerende kleurstof voor detectie van het gebiotinyleerde antigeen bindende cellen (Figuur 1). Eerdere studies hebben antigeenspecifieke B-cellen die in een vergelijkbare wijze maar met gebruik van antigenen rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom 8, 9, 10, 11. Hoewel dit is een waardigebenadering, gebruik van gebiotinyleerde antigenen in combinatie met streptavidine maakt grotere signaalversterking (dus betere differentiatie van bindende en niet-bindende cellen), met name wanneer antigenen kleine 12, 13, 14. Een aanvullende overweging is het gebruik van streptavidine in plaats van avidine omdat streptavidine gedeglycosyleerde, afneemt aspecifieke binding. Verder gebruiken we ver-rood-fluorescerende kleurstof als fluorochroom vanwege de fotostabiliteit, kwantumopbrengst (helderheid) en de kleine afmetingen (~ 1,3 kD). Eiwit fluorochromen zoals phycoerythrine (~ 250 kD) en allofycocyanine (~ 105 kD) 15 niet optimaal omdat veel potentieel antigene epitopen bevatten. Toepassing van een kleine organische fluorescente kleurstof uit één epitoop, zoals ver-rood-fluorescerende kleurstof, vermindert de complexiteit van de geïsoleerde celpopulatie.
Zodra cellen gebiotinyleerd-antigen en ver-rood-fluorescerende kleurstof-streptavidine geadsorbeerd, worden ze verrijkt met behulp van anti-ver-rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerde magnetische nanodeeltjes. Één nanodeeltjes worden niet herkend door de meeste flowcytometers en derhalve niet behoeven te worden verwijderd vóór zuivering door FACS sortering en downstream assays 16. Magnetische selectie van antigeenspecifieke B-cellen verrijkt de populatie van belang, waardoor de tijd en kosten van sortering zeldzame gebeurtenissen met een flow cytometer.
Hieronder tonen we representatieve resultaten van de verrijking van tetanus-toxoïde-specifieke B-cellen van een patiënt vóór en zeven dagen na tetanustoxoïd booster immunisatie. We kozen deze specifieke toepassing als bijvoorbeeld om het vermogen van deze methode om antigeenspecifieke B-cellen in vivo na acute stimulatie verrijking tonen. In combinatie met flowcytometrie is deze methode geschikt voor het verrijken en differentiëren antigeenspecifieke naïeve, geheugen, enplasmablast B-cellen en kan de onderzoeker aan veranderingen in de frequentie in de tijd te volgen. Bovendien nemen we een andere mogelijke downstream assay, zoals een ELISPOT assay, hetgeen aantoont dat cellen behouden het vermogen om antilichaam uitscheiden na verrijking. Een andere toepassing van deze werkwijze adoptieve overdracht van verrijkte cellen in een gastheer kunnen inhouden. We hebben eerder aangetoond cellen behouden het vermogen om als antigeenpresenterende cellen om antigenspecifieke T-cellen na isolatie en overdracht (gegevens niet getoond). Daarom zijn er een aantal mogelijke downstream assays die kunnen worden gekoppeld met de methode, die tezamen het begrip van de antigeen-specifieke immuunrespons informeert. We hebben de hieronder beschreven methode, met inbegrip van de controles aan de totale opbrengst, zuiverheid, cel specificiteit te bepalen, en vouw-verrijking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor isolatie en verrijking van antigeen-bindende B-cellen uit humaan perifeer bloed bereiken. De werkwijze is goed toepasbaar voor muizen en andere weefsels zoals de milt en lymfeklieren, en is compatibel met post-verrijking analyse van cel fenotype en functie (manuscript in voorbereiding).
De gebruiker moet zich bewust van een aantal variabelen die het succes van deze procedure kan beïnvloeden. Uit ervaring dode cellen meestal bij de magnetische kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
