Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Este protocolo se ha realizado con la aprobación de nuestro comité de revisión institucional apropiada con des-identificación de todos los datos del paciente y de acuerdo a todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Obtener toda la debida aprobación institucional junta de revisión y el consentimiento informado de la familia del paciente antes de trabajar con este protocolo. 1. obtener muestras de tejido NOTA: Un componente crítico de este protocolo requiere un manejo adecuado de la donación de tejidos a partir de inmediato en el momento de la autopsia. La viabilidad global de la muestra depende en gran medida de reducir al mínimo el intervalo post mortem (PMI), transferir inmediatamente el tejido en el medio frío adecuado suplementado con antibióticos / antimicóticos, manteniendo la muestra en hielo húmedo durante todo el transporte, y el mantenimiento de una técnica estéril durante todo el protocolo. Tras la notificaciónde una donación inminente, preparar un kit de recogida de muestras. El uso de una caja de envío con un recipiente aislado que se puede utilizar directamente para el transporte de vuelta de la muestra de tejido, incluyen los siguientes materiales: Incluir materiales para la preparación estéril, incluyendo guantes estériles, cortinas y escalpelos. Incluir 8 – 10 50 tubos cónicos estériles ml que contenían 30 ml de medios de envío en el recipiente aislado con hielo o compresas frías. NOTA: Si bien cualquier medio de cultivo celular estándar puede trabajar, la mejor viabilidad muestra se obtiene con Hibernate-A suplementado con antibióticos / antimicótico. Incluya todos los tubos de muestras adicionales para otros análisis (por ejemplo, fijadores). Si la autopsia no se llevará a cabo en las instalaciones del investigador, incluirá un documento que establece claramente cómo recoger la muestra de tumor. Esto incluye detalles tales como el mantenimiento de la esterilidad, manteniendo los tubos de muestras en hielo húmedo, e incluyendo muestras del cerebro medio y médula como tumor células a menudo invaden estas regiones. Mantener la esterilidad durante la autopsia. Considere el cerebro dentro del cráneo estéril, por lo que observar una técnica estéril (incluyendo guantes cambiantes) una vez que el cráneo está abierto. Evitar la contaminación con la piel y el cabello es crítico. Disecar el tumor desde el lado ventral (el "vientre" de la protuberancia, ver Adicional Figura 1). Con un bisturí estéril, cortar pequeños trozos de 1 cm de tumor y transferir inmediatamente en los medios de comunicación Envío frío (ver nota en el paso 1.1.2) y poner en hielo húmedo. Colocar 10 ml de tejido en cada tubo, lo que resulta en un volumen final de tejido y medios de comunicación en cada tubo de 40 mL. NOTA: En el caso de DIPG, el tumor infiltra difusamente la protuberancia y frecuentemente el resto del tronco cerebral. Como tal, recoger la mayor cantidad de la muestra como sea posible, típicamente incluyendo 3 – 4 tubos (30 – 40 ml de tejido) de protuberancia y 1 – 2 tubos (10 – 20 ml de tejido) cada uno de cerebro medio y médula. recoger samples del cerebro medio y médula yuxtapuesta a la protuberancia, que a menudo contienen muchas células tumorales. Después de la recogida de muestras, enviar las muestras S / N en el hielo húmedo en el contenedor aislado. No envíe la muestra en hielo seco, como la congelación mata las células. 2. Preparación para el Procesamiento de Muestras Antes de comenzar la preparación de muestras, esterilizar campana de cultivo de tejidos junto con hojas de afeitar, pinzas hemostáticas curvas, y cualesquiera otras herramientas no estériles bajo luz UV durante 1 h. Realizar todos los pasos siguientes en condiciones estériles para evitar la contaminación de los cultivos. Preparar y soluciones de filtro estériles. Para preparar la solución 1,8 M de sacarosa, se disuelven 308,07 g de sacarosa en 300 ml de agua destilada. Añadir 50 ml de 10x de Hank tamponada Solución Salina (HBSS) sin calcio o magnesio y llevar a volumen total a 500 ml con agua destilada. Almacenar a 4 ° C. Para preparar la solución de digestión enzimática, tomar 50 ml de HBSS con el calcio y el magnesio por cada 10 ml de tejido picado y añadir 500 l 5 mg / ml de desoxirribonucleasa I (concentración final de 50 mg / ml), 500 l 2,5 mg / ml de colagenasa I / II y la solución de dispasa (concentración final 25 g / ml) y 500 l de tampón 1 M HEPES. Precalentar solución de digestión en un baño de agua a 37 °. Para preparar los medios de la base del tallo del tumor (TSM), mezclar 250 ml Neurobasal-A, medio Eagle modificado de 250 ml Dulbecco: Nutriente F12 Mezcla (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiótico-antimicótico, 5 ml de 200 mM de L-alanil-L- dipéptido de glutamina (GlutaMAX-A), 5 ml de tampón HEPES, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, y 5 ml 100x MEM aminoácidos no esenciales. Para preparar completa TSM con factores de crecimiento, añadir los siguientes suplementos a base de TSM: 50x B27 Suplemento Minus vitamina A (1:50), factor de crecimiento epidérmico humano (H-EGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos humano (H- FGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas humano AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),humano derivado de plaquetas factor de crecimiento BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml), y la solución de heparina (2 mg / ml). Pre-enfriar una centrífuga de laboratorio equipado con un rotor basculante-cubo a 4 ° C. 3. disociación mecánica Transferir el tejido en un 100 mm x 20 mm placa de altas paredes de cultivo celular. Retirar los restos de los medios de envío y reemplazar con 10 – 15 ml de medio de cultivo frío. Usando las pinzas hemostáticas curvas para captar una hoja de afeitar, pelos en el tejido fino mientras se quita los vasos sanguíneos obvias o las meninges. NOTA: Los fragmentos de tejido finales deben ser menor que 1 mm (véase la figura 1B). Transferir el tejido en un tubo cónico de 50 ml limpio. Lavar la placa de cultivo celular con un adicional de 5 medios de cultivo frío mL y transferir al tubo cónico. Repita este paso de lavado si es necesario para transferir el tejido restante. Con una pipeta serológica de 10 ml, se tritura suavemente (4 – 5 veces). Permitir TISS más grandesfragmentos ue a depositan en el fondo del tubo. Si es necesario, se centrifuga brevemente la muestra durante 1 min (350 xg, 4 ° C). Recoger la fracción disociada mecánicamente. Eliminar el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml con la etiqueta "Mechanical disociación." Invertir el filtro sobre el tubo cónico original y lavar con medio de cultivo para recuperar los fragmentos de tejido. Se centrifuga la fracción "disociación mecánica" durante 5 min (350 xg, 4 ° C). Eliminar el sobrenadante de la fracción de granulado "disociación mecánica" y resuspender el tejido en medio de cultivo frío. Si hay más de 5 ml de tejido en el tubo cónico de "disociación mecánica", dividir el tejido dentro de otros tubos 50 ml cónicos de tal manera que no tubo tiene más de 5 ml de tejido. Almacenar la fracción disociada mecánicamente en hielo hasta la etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa (Step 5). Como alternativa, la fracción disociada mecánicamente puede proceder al paso 5 durante el período de incubación de disociación enzimática (Paso 4.4). 4. La disociación enzimática Si hay más de 5 ml de tejido en el tubo que contiene el resto de los fragmentos de tejido más grandes, dividir el tejido en otros nuevos tubos 50 ml cónicos de tal manera que no tubo tiene más de 5 ml de tejido. Centrifugar el tubo (s) cónica que contiene los fragmentos de tejido restantes durante 5 min (350 xg, 4 ° C). Eliminar el sobrenadante y añadir la solución de digestión enzimática precalentado, de manera que hay 5 solución de digestión ml por cada 1 ml de tejido (por ejemplo, 25 ml solución de digestión de 5 ml de tejido). Sellar las tapas de tubo cónico con película de laboratorio y se incuba la reacción en un aparato rotatorio a 37 ° C durante 30 min. Después de la incubación, las muestras se tritura suavemente (véase la Figura 1C). Con una pipeta serológica de 10 ml,pipeta de la muestra de arriba abajo 6 – 8 veces. Evitar la generación de burbujas de aire excesivas. Añadir una punta de pipeta 1.000 l hasta el final de la pipeta y se tritura un adicional de 6 – 8 veces. Permitir que cualquier trozos restantes a depositan en el fondo del tubo. Retire y filtrado del sobrenadante con las células que hayan quedado suspendidos a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml con la etiqueta "La disociación enzimática" y almacenar en hielo. Si los fragmentos de tejido quedan importantes, agregar un adicional de 10 ml de HBSS con calcio y magnesio a los fragmentos y repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2. Filtrar esta solución final a través de un filtro de 100 micras en el tubo "Enzymatic disociación". Centrifugar el tubo "Enzymatic disociación" de 5 min (350 xg, 4 ° C) y continuar a centrifugación en gradiente de sacarosa. 5. La sacarosa gradiente de centrifugación Si las muestras aún se suspenden en solución, centrifuge por 5 min (350 xg, 4 ° C). Quitar el tejido sobrenadante y resuspender en 20 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio. Se ajusta el volumen hasta 25 ml en total con HBSS frío. Añadir lentamente 25 ml de 1,8 M solución de sacarosa y el tubo para mezclar. Esto da lugar a un gradiente de 0,9 M de sacarosa. Centrifugar sin freno para 10 min (800 xg, 4 ° C). El uso de un freno de centrifugación interrumpirá el gradiente y reducir el rendimiento (véase la Figura 1D para un ejemplo de una muestra antes y después de la centrifugación). Con cuidado aspirar restos de mielina y tanto solución de sacarosa como sea posible. Lavar la muestra mediante la adición de 30 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio y mezclando suavemente. Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). Lisis Celular ACK 6. Rojo Sangre Eliminar el sobrenadante de lavado. Añadir 5 ml de tampón de lisis ACK y resuspender suavemente el sedimento celular, agitando el tubo durante 1 min a TA. Se detiene la lanalysis mediante la adición de 30 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio. Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). 7. Mantenimiento de Cultura Inicial Volver a suspender los sedimentos celulares finales en 10 – 15 ml tibia completa de TSM con factores de crecimiento y cuantificar la densidad de células viables en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano. NOTA: El rango de células viables varía ampliamente dependiendo de las circunstancias de la donación de tejidos, y la cuantificación puede ser difícil en esta etapa temprana debido a los desechos celulares sobrante. En un caso ideal, el objetivo de tener un millón de células vivas por muestra. En los casos en que un exceso de restos sigue siendo, la placa a una densidad más baja en un matraz T175. La transferencia de las suspensiones celulares finales a un nuevo matraz de cultivo T75. Spike en factores de crecimiento adicionales cada otro día para mantener los niveles generales de factores de crecimiento, y el monitor para el desarrollo de las neuroesferas de células tumorales (véase la Figura 1E y la Figura 2). Por otra parte, los procesos células disociadas enzimáticamente para su posterior análisis, incluyendo citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia. Tras el desarrollo de neuroesferas (que en promedio es de 3 – 4 semanas, pero oscila desde unos pocos días a tan largo como 2 meses), revertir filtro de la muestra utilizando un filtro de malla de nylon 100 micras para reducir la cantidad de desechos. NOTA: El filtrado debe mantenerse en cultivo en el caso de células individuales viables o esferas pequeñas están presentes. Asegurar la integridad y la pureza de la cultura mediante la realización de la huella de ADN, mientras que pases, en comparación con la muestra inicial del paciente.